Ion Torrent多基因平行测序技术筛选及鉴定肺腺癌主要的EGFR-TKI耐药驱动变异基因

Treatment with receptor-tyrosine kinase inhibitors (TKIs) has improved progression-free and overall survival in patients with advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). One major target for treatment with TKI is the epidermal growth factor receptor (EGFR), particularly in patients harboring activating mutations. There are, however, patients who do not demonstrate tumor response (termed 'inherent resistance') to TKIs. Despite initial responses and long lasting remissions, the development of secondary resistance (termed 'acquired resistance') inevitably leads to treatment failure. Tumor heterogeneity may foster tumor evolution and adaptation and hinder personalized-medicine strategies that depend on results from single tumor-biopsy samples. Previous study, we investigated the correlation between gene expression profiles, mutation status and clinical characteristics in 76 patients with non-small-cell lung cancer (NSCLC). Liquidchip technology was used to detect mRNA expression level of ERCC1, TYMS, RRM1, TUBB3, EGFR and mutation status of EGFR, KRAS, BRAF, PIK3CA. Different gene expression profiles were detected among NSCLC patients. In this study, Ion semiconductor sequencing on the Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) will be performed with the Ion AmpliSeq Cancer Panel to detect 739 hotspot mutations in 46 oncogenes and tumor suppressor genes on tumor DNA. We will reveal and define pathogenic driver mutations which lead to resistance to TKIs. So, improvement in personalized-medicine will be achieved through the development and use of targeted agents.

原发和获得性耐药导致表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂治疗中晚期非小细胞肺癌无效或失效。肿瘤遗传异质性可能是导致耐药的最主要原因。前期工作应用xTAG液相芯片技术分析76例非小细胞肺癌患者5个基因表达状态及4个基因突变状态，显示不同个体基因表达谱及突变分布频率不同，具有肿瘤遗传异质性，导致患者对EGFR-TKI药物的敏感性不同。本项目借助新一代半导体测序技术，平行测序46个癌症相关基因的739个突变位点，研究肺腺癌不同个体肿瘤间、同一个体瘤灶间及瘤灶内不同区域间肿瘤细胞中驱动基因的分布频率，揭示肿瘤遗传异质性；收集单纯TKI治疗的中晚期非小细胞肺癌患者的肿瘤组织及耐药后二次活检标本，通过多基因平行测序及基因组学数据整合，将靶向驱动基因分层，筛选、鉴定酪氨酸激酶抑制剂主要的原发及获得性耐药驱动基因变异，为今后研究肿瘤耐药分子机制及耐药逆转研究提供切入点，对实现患者个体化治疗具有重要意义。

目前表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI，简写为TKI）药物已进入中晚期非小细胞肺癌的一线治疗方案，但存在不明的原发性耐药机制导致TKI药物药效差或者无效，导致患者治疗失败。.为探寻TKI原发性耐药机制，我们计划采用新一代测序技术（NGS），寻找中国肺癌病人中TKI耐药相关的基因突变。 因此，我们首先建立了临床NGS分析实验系统（LIFE的PGM测序仪），通过对48例常规肺腺癌FFPE样本进行靶向测序（Targeted Sequencing）和数据分析，为临床样本的NGS分析做好技术储备。.我们原计划对TKI 药敏和耐药两组（各20 例）患者的FFPE组织标本进行NGS分析，但在执行过程中发现样本获取困难，有一线TKI用药记录且符合入组条件的病人稀少。通过一年的时间，我们共收集18例使用TKI一线治疗的、中晚期肺腺癌患者的肿瘤组织FFPE样本，其中8例患者对TKI治疗敏感， 10例对TKI治疗耐药。为了最大限度的利用这些珍贵临床样本，我们将原研究方案调整如下：.① 首先选取两对TKI耐药对比药敏的肺癌细胞系，通过全外显子测序（whole exome sequencing, WES）全方面寻找耐药相关基因突变。然后通过功能标注分析筛选有意义的基因突变，并在此基础上设计靶向测序Panel。最后使用临床FFPE样本进行深度靶向测序验证细胞系结果，从而高效锁定中国肺癌病人耐药相关基因突变。.② 本项目通过与美国UCSF经验丰富的临床生物信息学团队合作进行NGS数据分析，从细胞系中找到20个左右新颖并且显著影响生物学功能的基因突变，比如“耐药相关”的线粒体外膜装配基因HSP90AA1和SAMM50；“药敏相关”的B细胞分化相关基因NTRK1和气味感受相关基因OR9G1。.③ 我们正在把细胞系中发现的20个TKI耐药相关基因，结合已知17个肺癌驱动基因突变，设计成靶向测序panel。完成技术验证后，将对18例临床样本进行深度靶向测序，从而验证细胞系的发现，锁定中国肺癌病人TKI原发性耐药相关基因突变。.④ 本项目计划继续申请2015年国家自然科学基金面上项目，通过增大临床样本量，加做基因芯片分析等，评估以上研究发现的特定基因突变开发为中国肺癌病人TKI原发性耐药的分子标记物的可能性。该研究计划可能为TKI药物敏感性提供一种新的伴随诊断方法，有利于肺癌的个体化治疗。