粘虫毒蕈碱型乙酰胆碱受体基因的克隆与功能分析

毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M型受体）作为昆虫重要的神经递质受体，参与调节其各种神经生理活动，是杀虫剂的重要靶标。我们前期研究发现，M型受体参与调控昆虫的发育行为，但其信号转导途径及作用机理尚不清楚。本项目拟以粘虫为材料，采用RT-PCR及RACE技术获得M型受体的全长cDNA序列，构建原核表达载体，从mRNA和蛋白水平展开该基因在粘虫个体发育中的表达和定位研究；构建真核表达载体转染HEK293细胞，分析胞内信号转导途径；并结合RNAi技术研究M型受体在粘虫个体发育中的具体生理功能，从分子水平阐明M型受体在昆虫个体发育中的作用机理。该项目的实施可为防治以幼虫危害为重的鳞翅目害虫提供新思路，对开发以M型受体为靶标的新型农药具有重要的理论指导意义和潜在应用价值。

毒蕈碱型乙酰胆碱受体（muscarine acetylcholine receptor, mAChR）是昆虫体内重要的神经递质受体，参与调节其各种神经生理活动。但国内外对其信号转导途径及作用机理深入研究甚少。本项目以东方粘虫Mythimna separata（Walker）为研究对象，通过同源克隆方法获得mAChR A亚型基因cDNA序列，并对其在胞内的信号转导途径及生理功能进行了深入研究，主要取得了以下研究结果。. 获得粘虫M. separata mAChR-A基因全长cDNA序列2369 bp，开放阅读框1806 bp，编码602 个氨基酸残基，分子量为67.4 kDa。同源性分析表明该蛋白与意大利蜜蜂Apis mellifera mAChR-A 的氨基酸序列最大一致性达56%，与双翅目昆虫 mAChR-A 的亲缘关系最近。采用qRT-PCR技术分析显示，mAChR-A基因在粘虫整个发育过程中均有表达，以卵期及成虫期表达量最高，成虫期雌雄虫表达差异极显著，雌虫的表达量可达雄虫的20倍以上；组织表达分析表明雌雄成虫的马氏管表达量最高，中肠表达量最低；mAChR-A在雌雄成虫生殖系统的表达量差异最大，mAChR-A在雌虫卵巢内的表达量高于精巢200倍以上，雄成虫头部的表达量高于雌虫的4倍以上。蛋白定位分析表明，mAChR-A蛋白主要分布于卵母细胞的细胞膜及卵子的卵黄膜，马氏管组织定位发现mAChR-A主要分布于管壁细胞靠管腔内侧。以上结果说明mAChR-A在调节卵巢发育及排泄、渗透调节等方面起着重要作用。头部视叶、蕈形体和触角叶的阳性反应表明 mAChR-A可能参与了视觉和嗅觉信息的获取与整合。真核表达结合药理学分析发现mAChR-A受体可被毒蕈碱（EC50为5.844×10-7 M）和氨甲酰胆碱（EC50为1.246×10-7 M）激活并引起胞内钙离子浓度升高，此效应可被阿托品所抑制（IC50为0.09 nM）说明mAChR-A的胞内信号通路是磷脂酰肌醇通路。本项目研究结果表明，mAChR-A除了为大家熟知的在中枢神经系统起作用外，更为重要的生理功能是对排泄系统及雌性生殖系统的生理调节，这方面研究在国内外还未见报道。此外，mAChR-A与配体结合后是通过激活胞内磷脂酰肌醇通路发挥生理功能。