家鸡时钟基因调控蛋壳形成的分子机制研究

There is an obvious rhythm of eggshell formation. Until now, there is no study on the controlling mechanism of circadian rhythms on the eggshell formation process. In previous study, we found there were clock genes had rhythmic expression patterns like the cosine curve in the uterus of the oviduct, which implied biological clock may control the eggshell formation. Thus, our team formulate a hypothesis that biological clock may control the expression rhythms of the eggshell-related ions and their transporters via clockwork. We plan to select the layers with close laying time to determine their hormone concentrations in serum, to make clear the endocrine pathway which passing the external rhythms into internal environment. We also want to obtain the clock genes and clock-controlled genes via RNA-seq and ChIP-seq. Culture the epithelial cells sampled at uterus to determine the combining sites between the clock genes and clock controlled genes via dual luciferase reporter system. Artificially start the clockwork of epithelial cells to test the expression pattern of clock genes and clock-controlled genes. Our team try to explain the molecular controlling mechanism of eggshell formation in a biological clock way, which may through a light on a new method to understand the eggshell formation.

蛋壳作为鸡蛋的重要组成部分具有周期性形成的规律。目前，关于蛋壳形成过程中的昼夜节律调控机制研究尚属空白。本项目组前期研究发现时钟基因在鸡输卵管子宫部节律性表达，这暗示着生物钟可能调控蛋壳形成。因此，本项目提出时钟基因通过发条机制调控离子和离子转运协同蛋白等节律性表达，促使蛋壳周期性形成的科学假设，筛选产蛋时间一致的鸡只，测定24h周期内血液激素含量及子宫部时钟基因的表达水平，分析昼夜节律信息传递到子宫部的内分泌路径；采集子宫部进行转录组测序，筛选时钟基因和蛋壳形成相关钟控制基因；使用ChIP-seq钓取时钟基因蛋白结合的钟控制基因；体外培养子宫部上皮细胞，使用双荧光素酶报告系统鉴定钟控制基因和时钟基因结合位点；人工启动时钟基因发条机制，检测子宫部上皮细胞中时钟和钟控制基因的表达情况。本项目尝试从生物钟这一独特角度解释蛋壳周期性形成的分子调控机制，为研究蛋壳形成机理提供了新思路。

鸡的输卵管子宫部作为蛋壳形成的主要部位，可准确调取和运输蛋壳形成所需离子和转运蛋白等，从而维持24h一个周期的鸡蛋组装任务，本项目组前期研究发现时钟基因在鸡输卵管子宫节律性表达，因此，时钟基因可能通过发条机制调控离子和离子转运协同蛋白等节律性表达，促使蛋壳周期性形成。本项目以此为切入点，（1）选取产蛋时间一致、产蛋周期近似的鸡只作为试验材料，测定了24h 周期内试验鸡的血液激素水平，分析了激素昼夜变化规律。（2）筛选了节律表达的激素受体基因，使用候选激素处理了体外培养的子宫上皮细胞，探明了节律信息传导至子宫的分子途径。（3）采集了24h产蛋周期内的输卵管子宫部样本，通过转录组测序分析获得了与蛋壳形成相关的钟控制基因，构建了时钟基因调控蛋壳形成的节律信号传递网络。（4）细胞层面探明了时钟基因调控蛋壳形成相关钟控制基因的作用元件，明确了蛋壳周期性形成的分子机制。重要结果和关键数据：（1）产蛋高峰期的生殖激素含量高于育成期，不同时期同一时间点的激素含量有较大差异，激素受体基因mRNA表达量变化与相应激素水平变化一致；PGs可能参与蛋鸡的产蛋和排卵过程，E2和FSH可能在蛋壳形成过程中发挥调控作用。（2）Bmal1调节激素受体基因PTGFR的表达，激素PGF2α促进了子宫上皮细胞的增殖。（3）通过转录组测序结果分析发现，时钟基因Per2、Cry1、Bmal1、Clock、Per3和Rev- erbβ在子宫部节律性表达，基因顺式调控元件D-box、E-box、B-site和Y-Box的表达时间存在昼夜规律，子宫上皮细胞中离子转运关键基因SCNN1G、CA2、SPP1和ATP1B1的表达受时钟基因Bmal1的调控，并揭示了鸡蛋壳形成的昼夜节律调控关键途径。（4）通过转录组测序结果鉴定出六个节律性miRNAs，其中gga-miR-449c-5p和gga-miR-218-5p可分别靶向Ca2+转运ATP酶4 （ATP2B4）和碳酸酐酶Ⅱ（CA2）调控蛋壳矿化过程中的离子转运过程。本研究初步探明了家禽时钟机制参与蛋壳形成的关键分子途径，研究结果拓宽了研究蛋鸡连产性和畸形蛋形成的思路，为制定合理的鸡光照制度提供理论基础。