RNA CpG基序在DNA疫苗中免疫调节作用的研究

CpG RNA基序具有和CpG ODN一样的免疫调节活性并可启动机体的固有免疫应答。前期工作中，我们构建了表达结核杆菌保护性抗原Hsp65的质粒DNA疫苗，并在hsp65编码基因下游转录区插入特定合成的CpG基序，发现其转录后能以RNA形式发挥免疫调节活性，转染细胞后可诱导分泌较之不含CpG RNA的质粒DNA更高的IFN-a和IL-12，提示可产生提高的Th1型免疫反应。本研究中，我们拟首次尝试将CpG RNA在DNA疫苗中加以应用，并通过我们已建立的结核杆菌气雾攻击小鼠模型来评价其抗结核的免疫保护或治疗效果。接着，我们拟进一步将CpG RNA重组质粒转染不同的原代细胞或细胞系，并利用siRNA干扰的方法沉默一些胞内的靶基因如TLR、RIG-1家族包含的基因等，从而深入探求CpG RNA基序所激活的细胞信号通路及其启动固有免疫应答的机制，为开发更有效的CpG佐剂或免疫调节分子奠定基础。

质粒DNA 被认为是非常具有潜力的新型疫苗佐剂之一。人工合成的含有特定基序的短链DNA序列可以与宿主细胞表面的Toll 样受体结合从而激活固有免疫应答。这类DNA 具有一类特殊的结构，即含有非甲基化的胞苷磷酸鸟苷(CpG)二核苷酸核心及特定的侧翼序列，称为CpG-DNA。质粒DNA 并非一定与DNA 受体相结合才能发挥其免疫调节活性。如果免疫调节序列位于转录区，那么该序列转录后也能发挥免疫调节活性，这样的序列分子即称为RNA CpG序列，一个质粒DNA 可以表达多个这样的RNA CpG 序列从而发挥其免疫调节作用。本研究中，我们在质粒DNA 疫苗的转录区插含CpG RNA 基序的特定序列，希望该特定序列可以同时激活TLR和RIG-1信号通路，启动固有免疫，从而作为疫苗佐剂有效地加强DNA 疫苗的免疫效果。. 因此，我们按照原定的研究计划，合成了这样的二段CpG ODN 序列，并构建了表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)保护性抗原Hsp65 的重组DNA 质粒。我们将该CpG ODN 特定序列插入到质粒DNA 的hsp65 编码基因下游，得到含CpG RNA 序列的重组质粒pVAX1hsp65CpG01与 pVAX1hsp65CpG02。用该重组质粒DNA转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7，可诱导细胞分泌较之不含CpG RNA基序的重组DNA 更高水平的Th1 (IFN-a、IL-12, 而非Th2 (IL-4、IL-10)细胞因子，提示CpG RNA基序确实能够诱导产生更高水平的Th1型免疫应答。体内免疫原性分析发现CpG01或CpG02基序插入的质粒DNA能诱导免疫小鼠脾细胞产生的细胞因子与IgG2a的表达水平明显增加，且CpG02能更有效的诱导Th1型细胞因子IFN-g与IL-12的分泌。感染动物试验结果则证实了hsp65质粒DNA治疗能明显降低感染小鼠的肺和脾的细菌载量，而插入CpG01或CpG02 RNA基序的重组质粒DNA组导致了感染小鼠肺的荷菌量显著降低，表明CpG基序的插入提高了质粒DNA的治疗效果。细胞水平的机制分析发现在DNA疫苗非转录区插入的RNA CpG主要是通过TLR-7和RIG-I通路增强Th1型免疫反应，从而诱导产生增强的免疫刺激效果。