多巴胺受体DRD1/NLRP3/Caspase-1通路调控固有免疫激活致肾脏炎症损伤的机制研究

We have confirmed that Dopamine receptor deletion can cause kidney inflammation, but the mechanism is not clear. Recently it was reported that dopamine receptor DRD1 could directly inhibit the pattern recognition receptor NLRP3, which could activate Caspase-1 and regulate innate immune response. It is speculated that DRD1 deletion can activate NLRP3, thereby activating innate immunity and promoting renal inflammation. We found that the expression of NLRP3 in glomeruli of patients with crescent glomerulonephritis increased with macrophage infiltration, suggesting innate immune activation. This study will use RNA interference and gene transfection to regulate the expression of DRD1 or NLRP3 in renal intrinsic cells, macrophages and Drd1-/- mice to observe inflammation and related pathways; and to construct models of unilateral obstructive nephropathy or crescent glomerulonephritis using Drd1-/- mice and Nlrp3-/- mice, observing the effects of corresponding gene knockout on disease progression and the curative effects of renal rescue of the deficient gene; at the same time, we enrolled the nephritis patients to screen of DRD1 single nucleotide polymorphism (the loci in populations are of high incidence). Thus, we will prove the DRD1/NLRP3/Caspase-1 pathway and its regulation on renal inflammation, and explore the genetic background of disease susceptibility.

课题组前期研究发现多巴胺受体(DRD)缺失可导致肾脏自发炎症，但启动机制未明。近期报道DRD1可直接抑制模式识别受体NLRP3，后者可活化Caspase-1，调控固有免疫反应。由此推测DRD1缺失可激活NLRP3，从而激活固有免疫，导致肾脏炎症。课题组已发现新月体肾炎病变肾小球内NLRP3表达增高伴巨噬细胞浸润，提示固有免疫激活。本研究将进一步采用RNA干扰、基因转染等单独或联合调控DRD1、NLRP3，观察肾固有细胞、巨噬细胞及Drd1-/-小鼠的炎症表现及相关通路；并利用Drd1-/-小鼠、Nlrp3-/-小鼠建立单侧梗阻性肾病、新月体肾炎模型，观察相应基因敲除对疾病的影响，及肾脏定向转染缺失基因的疗效；同时，纳入肾炎患者，筛查DRD1 单核苷酸多态性位点(该位点人群较高发)。由此，将明确DRD1/NLRP3/Caspase-1通路及其对肾脏炎症的调控机制，并探索疾病易感性的遗传背景。

课题组前期研究发现多巴胺受体(DRD)缺失可导致肾脏自发炎症，但启动机制未明。本课题在研究中发现应用多巴胺激动剂以及外源性过表达DRD1可以减轻LPS引起的细胞炎症和NLRP3的表达，且体内敲除NLRP3可以减轻UUO和糖尿病带来的肾脏损伤，但DRD1在肾小管上皮细胞中表达丰度较低，在上述模型中DRD1表达水平较低且结果稳定性不佳，DRD1对NLRP3的直接调控作用及机制尚不能证实，进一步实验的意义与应用前景受限。由此，我们对实验方案进行了调整，在IR诱导急性肾损伤后发生肾纤维化模型和经典纤维化模型UUO中重新进行RNA-seq筛选差异性表达的circRNA。我们鉴定了一种保守的环状RNA(circRNA)，即circPTPN14，它在经活检证实为慢性间质性肾炎的患者的肾脏中、纤维化模型小鼠肾脏和TGFβ1刺激的肾小管上皮细胞(TECs)中高度表达。通过体内肾脏原位注射circPTPN14 shRNA可以显著减轻小鼠由于IR和UUO引起的肾脏损伤和纤维化进展。体外敲低circPTPN14可抑制TGFβ1诱导的促纤维化基因表达，而过表达circPTPN14则会促进TGFβ1的作用。circPTPN14的促纤维化功能归因于调控MYC及其靶基因的转录。FUBP1是一个DNA结合蛋白，主要通过和MYC基因启动子上游元件FUSE的相互结合作用促进MYC的转录，我们发现circPTPN14与FUBP1蛋白的KH3和KH4结构域结合，以增强 FUBP1 和 FUSE之间的相互作用，这是MYC转录起始所必需的。随后，在来自30例活检诊断为肾间质纤维化患者的样本中，circPTPN14的表达水平与肾脏MYC蛋白的表达呈正相关（r = 0.59，P < 0.001）。综上所述，我们的研究结果描述了一种新的circRNA，并揭示了circRNA在肾纤维化中的功能新机制，可作为慢性肾脏疾病诊断和治疗价值的靶点。