转基因金柑外源基因的清除

With the transgenic plants commercialized, the biosecurity had created public anxiety, which seriously restricted its application. 'Gene-deletor' technology was an improvement of site-specific DNA recombination system, providing an effective way to solve the biosecurity problem. In this project, 'Gene deletor' transgenic kumquat(F.crassifolia) obtained by ourselves as experiment materials, will be evaluated by analyses of exogenous gene deletor in tissues and organs and offspring. During the growth of sexual embryo and nucellar embryo, the deletion of all exogenous genes in transgenic kumquat will be observed in cellular and molecular level, and the mechanism of gene deletion driven by pollen and seed specific promoter PAB5 will be discussed. The efficiency of gene deletion driven by fruit specific promoter E8 instead of PAB5 will be analyzed. These works will provide theoretical basis for application of 'Gene deletor' technology into citrus and have very important significance to enhance the biosecurity of transgenic citrus.

随着转基因植物商业化，其安全性问题已引起了公众的普遍担忧，严重制约转基因技术成果推广应用。'外源基因清除'技术是位点特异性重组酶系统的一种改进技术，为解决转基因植物的安全性问题提供了一条目前最为有效的途径。本项目以获得的转基因金柑为研究对象，利用'外源基因清除'技术对转基因金柑及其后代中各个组织器官的外源基因进行清除，并通过对清除结果进行全面分析，评价'外源基因清除'技术在转基因金柑上的应用效果。从细胞水平和分子水平上分析在有性胚、珠心胚形成过程中花粉、种子特异性启动子PAB5诱导外源基因清除的时空变化。利用果实特异性启动子E8置换启动子PAB5，并导入金柑中，分析启动子E8在转基因金柑果实发育过程中诱导外源基因的清除效果。旨在为'外源基因清除'技术在柑橘上的应用提供理论依据，这对提高我国转基因柑橘产品的安全性具有极其重要的意义。

转基因生物安全性问题已引起了全世界的高度关注。目前美国康涅狄格大学李义教授研究提出的“外源基因清除”技术（‘gene-deletor’），被认为是解决转基因生物安全性最有效途径之一。鉴于“外源基因清除”技术在柑橘等木本植物上的应用还未见报道。为了探明该技术在柑橘上的应用条件和外源基因清除效果，本项目以前期获得的“外源基因清除”转基因金柑为研究对象，分析转基因金柑中各个组织器官及其后代的外源基因清除，评价“外源基因清除”技术在转基因金柑上的应用效果，旨在为“外源基因清除”技术在柑橘上的应用提供理论依据。.通过本项目的研究，利用GUS组织染色、PCR检测、Southern blotting检测以及Real-Time PCR分析转‘gene-deletor’基因金柑，结果表明外源 ‘gene-deletor’基因已整合到金柑基因组中，并得到了表达。转基因植株和未转化植株在株高、生长势等形态特征方面差异不显著。利用GUS组织染色和Real-Time PCR技术分析转‘gene-deletor’基因金柑的不同组织部位中的外源基因清除情况。结果显示外源基因存在转基因金柑的叶片和茎段中，还没有发生清除现象。Real-Time PCR结果说明CaMV 35S启动子诱导了nptⅡ基因在转基因金柑叶片、茎段中表达，而花粉、种子特异启动子PAB5诱导的FLP基因在转基因金柑叶片、茎段中不表达，结果说明花粉、种子特异启动子PAB5在金柑中具有组织特异性。在转基因金柑中的外源基因清除时间分析中，证明外源基因已从花粉成熟期中完全清除。由于外源基因清除载体中花粉、种子特异启动子PAB5存在只能提高转基因金柑环境安全性，为了提高转基因金柑食用安全性，从樱桃番茄中克隆果实特异启动子E8，置换外源基因清除载体中花粉、种子特异启动子PAB5，改造了外源基因清除载体为Y-A-E8，再利用农杆菌介导将Y-A-E8转入实生态金柑中，通过分子检测获得了6株转基因植株。.项目研究结果对于提高柑橘转基因育种的安全性具有极其重要意义。同时，在该项目资助下，目前共发表研究论文3篇。