Smurf2对糖尿病肾病发生发展中SnoN蛋白表达的调控作用及机制研究

SnoN is a key inhibiting factor of TGF-β1/Smad signaling pathway, and it plays important role in the Diabetic Nephrology(DN). However, the regulatory mechanism of SnoN in DN remains unkown. Our previous study suggested that the level of SnoN protein in the kidney of diabetic rats decreased significantly. Moreover, the SnoN protein level was negatively correlated with the level of Smad ubiquitination regulatory factor-2(Smurf2). Therfore, we inference that the decreased SnoN protein level is caused by Smurf2. We planed to perform the study include:1.To clarify the regualtory effect of Smurf2 on SnoN,the expression of Smurf2 and SnoN in the diabetic rats which include the smurf2 knockdown and overexpressed gene will be measured.2.To clarify the regulatory mechanism of Smurf2 on SnoN, the interaction between SnoN and Smurf2 in renal tubular epithelial cell will be identified by immunoprecipitation experiments. The study may provide the theoretical and experimental basis on the anti-fibrosis of SnoN protein in diabetic nephropathy.

SnoN为TGF-β1/Smad信号负调控因子，其水平降低与糖尿病肾病（DN）发病相关，但降低机制不清楚。我们研究发现：SnoN主要表达于肾脏的肾小管上皮细胞；DN肾组织中SnoN蛋白减少，mRNA水平无变化，且与泛素化降解SnoN的关键酶Smurf2呈负相关。因此我们推测DN肾组织中SnoN蛋白减少是由Smurf2介导的泛素化降解所致。本课题：①通过腺病毒转染分别敲低和过表达DM大鼠肾组织Smurf2，观察肾组织SnoN蛋白的表达量和降解率，明确Smurf2对SnoN蛋白的降解作用。②高糖刺激原代大鼠肾小管上皮细胞：阻断TGF-β1信号，观察阻断后Smurf2与SnoN蛋白表达量及降解率的关系，分析TGF-β1信号对Smurf2降解SnoN的影响；免疫共沉淀检测Smurf2与SnoN2蛋白的相互作用，明确Smurf2降解SnoN蛋白的分子机制。本研究将有利于深入阐明DN的发生发展机理。

研究背景：SnoN表达降低在糖尿病肾病（DN）发生发展过程中起着关键作用。但是，在DN发病中SnoN蛋白减少的机制尚不清楚，有待进一步研究。本研究拟探讨Smurf2在DN发生发展中对SnoN蛋白降解的作用及机制。.方法:（1）建立DN大鼠模型，分为：Smurf2干扰组、AD-shNC组、Smurf2过表达组、AD-NC组、假手术组、空白对照组。采用肾静脉注射方法向DN大鼠左肾转染Smurf2过表达及Smurf2干扰腺病毒载体。通过qt-PCR、Western blotting、免疫组织化学染色方法，从体内明确Smurf2对SnoN的作用。.（2）按细胞培养液的不同将hRPTECs分为3组：对照组，高渗组和高糖组。应用RNA干扰技术，将Smurf2 siRNA转染入hRPTECs中，高糖刺激后检测各组SnoN蛋白水平。hRPTECs在高糖环境下给予蛋白酶体抑制剂MG132处理48h，检测SnoN蛋白水平变化。应用免疫共沉淀检测高糖环境下hRPTECs中Smurf2和SnoN的相互作用。采用不同浓度的TGF-β1Ⅰ型受体阻断剂的高糖培养液孵育细胞48h，测定P-Smad2，Smad2和Smurf2蛋白表达的变化。.结果：（1）动物实验：Smurf2过表达组中：大鼠肾组织Smurf2的mRNA水平显著高于对照组，但SnoN mRNA水平无显著变化。在蛋白水平上，Smurf2的表达显著升高，SnoN的表达下调。Smurf2干扰组：大鼠肾组织Smurf2的mRNA水平显著降低，SnoN mRNA水平无明显变化；在蛋白水平上，Smurf2的表达显著降低，SnoN的表达上调。.（2）细胞实验：与对照组相比，高糖组hRPTECs中SnoN蛋白表达水平明显降低，SnoN mRNA水平却明显升高；而Smurf2 mRNA和蛋白表达水平均明显升高。敲低hRPTECs中Smurf2蛋白表达后再给予高糖刺激，转染组细胞SnoN蛋白表达水平明显升高。在高糖环境下hRPTECs中存在Smurf2和SnoN的相互作用。给予不同浓度SB-431542干预后，高糖环境下诱导的P-Smad2蛋白表达的上调受到明显抑制，Smurf2蛋白表达水平亦较单纯高糖组明显减少，且呈剂量依赖性。.结论：Smurf2对SnoN的降解是DN中SnoN蛋白水平降低的重要原因，且受TGF-β1/Smad通路调控。