N-糖基化作用对新型链霉菌木聚糖酶基因功能性表达的影响机理研究

In current project，in vitro site-directed mutagenesis will be used to modify the N-glycosylation sites of Streptomyces rameus L2001 to obtain N-glycosylation sites deletion mutants and wild gene recombinant. The location and forms of recombinant and mutation xylanase in secretory pathway will be determined through pulse-chase approach and immunoprecipitation. Spectrum technology is applied to obtain the information of advanced structure of the recombinant and mutation xylanase, and then analyze the difference and relevance between two xylanases. The 3D structure will be simulated to analyze the molecular comformation influenced by N-glycosylation, and identify the molecular configuration of core-glycosylated protein. This project reveals the role of N-glycosylation in the functional expression of xylananse gene from Streptomyces rameus L2001. In addition, the successful implementation of this project will provide the theoretical and data evidences for improving the expression efficiency of eukaryotic expression systems, and promoting the expanded production process of xylananse products. In a word, the project exhibits important scientific and social contribution.

本课题拟采用体外定点突变技术改造枝链霉菌Streptomyces rameus L2001木聚糖酶的N-糖基化位点，获得N-糖基化位点缺失的稳定突变体及野生基因重组体。采用脉冲标记及免疫沉淀反应追踪重组酶及突变酶的合成分泌位置并确定蛋白质状态，阐明N-糖基化作用对木聚糖酶异源表达分泌途径及方式的影响；运用光谱技术，确定重组酶及突变酶的二、三级结构信息，探讨重组酶及不同N-糖基化位点突变酶的结构差异性及相关性，揭示N-糖基化作用影响木聚糖酶分子结构的规律及特点；计算机模拟突变酶三维结构，综合分析N-糖链修饰对突变酶分子构象的影响，确定关键N-糖基化位点糖链修饰的酶分子构型特征，从分子水平揭示N-糖基化作用对木聚糖酶功能性表达的影响机理。本项目的成功实施将为提高真核表达系统的高效表达效率提供理论依据及基础数据，为推进木聚糖酶扩大化生产进程奠定科学基础，具有重要科学价值及社会意义。

N-糖基化是真核生物最常见的翻译后修饰之一，对蛋白质的分泌、活性、结构和功能有着重要影响。本项目从土壤样品中成功筛选获得了新型木聚糖酶生产菌株-枝链霉菌L2011，并成功构建了重组木聚糖酶基因xynA的酵母工程菌，通过G418抗性筛选得到一株高拷贝菌株GS115/pPIC9K。采用SDS-PAGE电泳结合糖蛋白染色技术初步探究糖基化抑制剂衣霉素的添加对酶的分泌表达及酶学特性的影响。研究结果表明随着N-糖基化作用被抑制程度的增加木聚糖酶的分泌量明显降低，且热稳定性较差，说明N-糖基化作用对酶的功能性表达及热稳性有积极作用。解析木聚糖酶基因信息，确定了木聚糖酶基因xynA 共有5个N-糖基化位点，即39，68，92，100，218位。采用定点突变法构建N-糖基化位点缺失突变体库，经遗传稳定性检测筛选稳定突变菌株。测定木聚糖酶分泌量及蛋白表达量，结合蛋白质分子量分布，确定N-糖基化位点的缺失对木聚糖酶基因功能性表达的影响。系统研究重组酶及突变酶的酶学特性，对比各N-糖基化位点缺失突变体的木聚糖酶酶学性质差异，初步判定关键N-糖基化位点；利用计算机三维模拟手段，对关键N-糖基化位点进行结构解析，结合特性数据分析，从分子层面确定了位点39、100及218是木聚糖酶XynA 功能性表达的关键N-糖基化位点，并从分子水平揭示N-糖基化作用对木聚糖酶功能性表达的影响机理。本项目的圆满完成对工业化应用毕赤酵母表达功能性外源蛋白具有理论指导意义。