普通烟草中两个新的叶绿素代谢相关基因的克隆与功能研究

Chlorophyll is one of the most important components of photosynthesis system and its metabolism plays an irreplaceable role in maintaining the stability of global ecosystem. In the past decades, the molecular mechanism of chlorophyll metabolism has been revealed preliminarily by analyzing a large number of genes related to leaf color. However, due to the lack of important mutants, many details of this molecular mechanism have not been clarified at present. Therefore, identification of more mutants related to chlorophyll metabolism is an important way of continuing the in-depth study on the molecular mechanism of chlorophyll metabolism. In the previous studies, we identified a white stem mutant with a defect in chlorophyll metabolism from common tobacco (Nicotiana tabacum L.). We analyzed the inheritance of the mutant trait and mapped the two recessive controlling genes on two definite intervals of two chromosomes, respectively. The results of fine mapping further implied that the two genes might be two novel genes related to chlorophyll metabolism, which suggested that studies on the two genes might reveal some novel molecular mechanisms of chlorophyll metabolism. In this proposal, on the basis of these previous results, we are going to clone the two genes and perform a series of functional analyses to verify the biological functions of the two genes and further clarify their roles in chlorophyll metabolic pathways. These study results will facilitate the better understanding of the molecular mechanism of chlorophyll metabolism.

叶绿素是光合作用的重要组分，其代谢对维持全球生态系统的稳定具有不可替代的作用。过去十几年来，通过对大量叶色相关基因的分析，人们初步认识了叶绿素代谢的分子机制，但由于重要突变体材料的缺失，这种认识还不全面。因此，加强对叶绿素代谢相关突变体的创制和鉴定是进一步深入研究叶绿素代谢分子机制的重要途径。我们在前期的研究中对普通烟草中一个叶绿素代谢缺陷的白茎突变体进行了遗传分析和基因定位，将两个隐性控制基因分别定位在两条染色体上。精细定位的结果进一步暗示，这两个基因很可能是两个新的叶绿素代谢相关基因，具有重要的研究意义。本项目拟在此基础上，通过对这两个基因进行克隆和一系列功能分析，验证它们的生物学功能，并进一步阐明其参与的叶绿素代谢途径。相关研究结果将有助于人们进一步加深对叶绿素代谢分子机制的认识。

异源四倍体普通烟草是研究植物分子生物学的模式植物之一，然而其巨大复杂的基因组使得烟草重要性状控制基因的鉴定变得异常困难，也限制了这些基因在很多方面的应用。本研究在前期对白肋烟性状遗传规律分析和基因定位的基础上，通过在定位群体构建和分子标记开发方面系统改进图位克隆技术，最终分离了控制白肋烟性状的一对重复基因WS1A和WS1B。序列分析发现，WS1A位于第二外显子的一个8-bp缺失和WS1B位于第九外显子上的一个1-bp插入分别导致了基因的移码突变。遗传互补和定量RT-PCR分析发现WS1A和WS1B互为功能性同源基因，二者具有基本相同的生物学功能和高度相似的表达模式，它们主要在生长旺盛的幼嫩绿色组织，如叶片和韧皮部中表达。序列分析发现，WS1A和WS1B分别来源于异源四倍体普通烟草的两个二倍体祖先种林烟草和绒毛状烟草。微共线性分析进一步显示，WS1A和WS1B侧翼染色体片段在野生种与栽培种之间，以及栽培种内部存在高度一致的基因排列顺序，表明WS1A和WS1B可能起源于相同的祖先。WS1A和WS1B编码M50家族的金属蛋白酶基因，BLAST分析发现，二者是拟南芥EGY1和番茄L2在烟草中的功能性同源基因，这四个基因的编码蛋白在3个类EGY1基序和8个跨膜结构域上高度保守。蛋白质定位预测发现，WS1A和WS1B主要定位在质体中。透射电镜分析发现，与野生型比较，突变型白肋烟的叶绿体类囊体膜被完全破坏，表明WS1A和WS1B可能主要通过控制叶绿体类囊体膜的形成来影响叶绿体的发育，从而最终影响叶绿素的代谢。此外我们还发现，随着叶片的衰老，叶绿体淀粉粒的降解和质体球的膨大速度在突变型白肋烟中要显著快于野生型，暗示WS1A和WS1B可能也参与了叶绿体中的一些次生代谢过程。我们最后还对白肋烟的起源进行了初步的探讨，对253份野生型烟草种质的基因型分析表明，WS1A和WS1B先后发生的突变最终导致了白肋烟的出现。本研究成果有助于多倍体作物的基因定位克隆和分子标记辅助改良。