羽衣甘蓝红色心叶基因Re的克隆

Kale is the important foliage plant in spring and winter. In the previous studies, we found the red inner leaves and white inner leaves of Kale are controlled by allele Re/re, and have obtained 3 SRAP markers linked with this genetic locus. In the present studies, an F2 population with isolated microspore culture individuals was generated from a DH-05 × DH-10 cross, which are excellent DH lines having red and white inner leaves, respectively. Currently, we aim to carry out fine mapping of the Re/re locus with SSR and SRAP markers by conducting map-based cloning strategy, construct the fine physical map covering the Re/re region to predict the potential coding gene with genomic sequencing datas of Brassica oleracea, analyze the gene expression model of the potential coding genes, and finally clone this Re/re gene for the marker-assisted selection (MAS) strategy in the breeding program of red inner leaves Kale. The cloning of this gene will provide us a better view to study the mechanism of leaves color formation and breed the new cultivar of ornamental plant by genetic engineering strategy.

羽衣甘蓝是冬春季节重要的观叶植物。在前期研究中，申请者发现羽衣甘蓝红色心叶和白色心叶性状由1对等位基因控制（Re/re），并找到了与该基因位点连锁的3个SRAP标记。本研究拟遵循图位克隆策略，以羽衣甘蓝小孢子培养获得的红色心叶DH系‘DH-05’与白色心叶DH系‘DH-10’杂交，构建大规模 F2 分离群体，利用SSR和SRAP引物，进行 Re 基因的精细定位；同时跟踪甘蓝基因组测序结果，构建覆盖 Re 基因区域的精细物理图谱，预测定位区域内编码基因；通过推测定位区域内编码基因的功能，分析其序列多态性及时空表达模式，最终克隆 Re基因，并建立用于红色心叶和白色心叶性状的分子标记辅助选育标记群。Re基因的克隆，可为进一步研究植物叶片呈色机理提供素材，也将为利用基因工程手段培育观赏植物新品种提供重要的候选基因。

羽衣甘蓝叶色丰富多变，叶形姿态各异，已成为园林绿化中重要的景观植物，其与众不同的观赏性状值得育种工作者的关注。本研究采用游离小孢子培养的方法，以多个具有优良观赏性状的羽衣甘蓝F1商品种为试材，进行悬浮液体培养，获得具有目标性状的DH系用于叶色分离群体的构建及后续其它农艺性状的研究。以获得的颜色差异明显的红叶DH系和白叶DH系为亲本，构建F2分离群体，利用全基因组重测序技术，通过亲本重测序及BSA的方法，分析确定羽衣甘蓝红叶性状关联的重要基因位于C9染色体上。通过同源克隆技术从紫色叶羽衣甘蓝中克隆与花青素合成相关的MYB转录因子BoMYB，该基因与甘蓝型油菜MYB序列的一致性最高。对不同组织表达水平分析表明，BoMYB基因表达具有组织特异性，且与各组织中花青素含量相关。构建BoMYB过表达载体，通过农杆菌介导的沾花法遗传转化拟南芥，获得转基因拟南芥株系，结果显示BoMYB 已成功整合入拟南芥基因组中, 并在mRNA水平表达。BoMYB基因异源过量表达使转基因拟南芥植株花青素含量增加,转基因拟南芥的叶片、茎段、根等颜色发生变化, 呈现出不同程度的紫色。且表达水平高低直接影响其花青素含量。因此推测，BoMYB 为一个正向调控羽衣甘蓝花青素的合成的MYB 转录因子。上述研究结果，为研究羽衣甘蓝叶色形成机制及叶色控制基因筛选奠定基础，并为彩叶植物育种提供了新的思路。