ANXA1调控mTOR通路在胃癌侵袭转移中的机制研究

约60%以上胃癌患者手术时即存在淋巴结和/或脏器转移，且转移是判断胃癌患者预后的独立因素，然而胃癌转移机制仍不明了。我们前期工作发现钙离子结合蛋白ANXA1和mTOR通路分别和胃癌淋巴结转移密切相关，且均与胃癌患者预后有关。新近文献报导ANXA1与mTOR通路上游分子（AKT和Grb2）在结构和功能上高度关联，我们推测ANXA1可能间接或直接作用于mTOR通路，继而促进胃癌的侵袭和转移。然而ANXA1和mTOR通路之间的调控关系未见研究报道。本研究拟应用组织芯片、基因转染、siRNA干扰、药物阻断以及相关分子生物学技术在组织学、细胞学和功能学水平研究两者的相关性以及调控方式，旨在探讨ANXA1在胃癌转移中的作用机制，丰富和完善mTOR通路，为mTOR及其通路在胃癌诊治和转移干预方面提供新的实验依据和新的靶点。

目的:探讨ANXA1在肿瘤中的表达谱系，并研究ANXA1作用于胃癌细胞增殖侵袭的分子生物学机制。方法:利用荧光定量RT-PCR技术检测ANXA1在消化道肿瘤中的表达，并构建这些肿瘤的组织芯片，利用免疫组化和Western blotting技术检测ANXA1在消化道肿瘤中的表达情况；利用RT-PCR、免疫组化和免疫荧光技术分析ANXA1在胃正常组织和胃癌组织中的表达，观察胃癌发生中ANXA1的表达改变；检测ANXA1 mRNA和蛋白在人胃癌细胞株中的表达和定位，并比较ANXA1表达差异细胞的增殖能力和侵袭能力的区别；过表达ANXA1，利用CCK8法、划痕实验和Transwell小室观察AGS和N87细胞增殖能力和侵袭能力的改变，并用Western blotting和免疫荧光等方法检测mTOR通路相关蛋白。结果:ANXA1在消化道肿瘤中的表达存在较大差异，胰腺癌中表达明显升高，食管癌中普遍下降，其他肿瘤中则变异较大；多种方法均显示正常胃粘膜上皮高表达ANXA1，而肿瘤中则呈下降态势，早期胃癌表达较高，随着肿瘤进展，其表达显著下降；ANXA1在AGS细胞低表达，而在N87中高表达，其表达趋势与胃癌细胞的增殖和侵袭能力相关；过表达ANXA1后，胃癌AGS细胞的形态学发生了明显改变，部分细胞变大变圆，并吞噬周围细胞，且细胞增殖变缓，侵袭能力减弱。蛋白电泳显示过表达ANXA1后磷酸化mTOR和磷酸化Akt表达明显下降，同样磷酸化ERK1/2表达亦有下降，细胞周期调节蛋白Cyclin D1表达明显下降。敲降ANXA1后N87细胞的增殖活性明显升高，伴有pAkt的过度表达。另外，我们发现自噬相关蛋白Beclin 1和LC3B在过表达ANXA1后明显升高，提示ANXA1通过提高肿瘤细胞本身自噬能力抑制胃癌细胞增殖和转移；进而我们检测了Beclin 1和LC3B在胃癌中的表达，两者在胃癌中呈低表达趋势，而且与ANXA1的表达呈正相关。结论:ANXA1在肿瘤中的表达具有器官特异性。胃癌中ANXA1主要以低表达为主，且与胃癌进展和胃癌细胞的恶性生物学行为高度相关。ANXA1通过抑制mTOR/Akt通路和ERK通路发挥其抑癌作用；深入研究显示ANXA1能够引起胃癌细胞形态学的改变，诱使胃癌细胞高表达LC3B，通过自我吞噬引起细胞增殖活性和侵袭能力的抑制。