肝素寡糖的化学酶法合成、抗肿瘤转移作用及其机制研究

To investigate the anti-metastasis domain of heparin, heparin biosynthesis enzymes including backbone synthase, C5-epimerase and sulfotransferase were expressed in E coli.Heparin oligosaccharides with different size, epimerization and sulfation patterns will be synthesized by chemoenzymatic method and analyzed by mass spectrum and NMR. Based on the effects of heparin oligosaccharide on tumour proliferation, adhesion and invasion in vitro, inhibitory effect of oligosaccharides on tumor metasis in vivo will be evaluated by murine Lewis lung carcinoma metastasis, B16F10 spontaneous metastasis, B16F10 lung metastasis, U14 murine cervical carcinoma adhesion and Walker 256 osteocarcinoma adhesion models. The effect of heparin on adhesion molecules (ICAM-1, P- or L-selectin), angiogensis and related factors will be determined by immunohistochemistry, western blot and RT-PCR. The research will help to understand hepairin's anti-metastasis from structural chariterization, as well as synthesize stucturally defined active heparin oligosaccharides and elucidate its mechanism.

为研究肝素抗肿瘤转移的活性结构单元，本项目拟采用基因工程技术重组表达肝素生物合成的糖链骨架合成酶、C5-异构化酶及硫酸基转移酶，结合化学技术合成不同异构化、硫酸化修饰的肝素寡糖，质谱及NMR鉴定结构；在体外测定肝素寡糖对肿瘤增殖、黏附与侵袭影响的基础上，采用Lewis肺癌自发性肺转移模型、黑色素瘤B16F10自发性转移模型、黑色素瘤B16F10人工肺转移模型、U14小鼠子宫颈癌肾侵袭模型和Walker 256癌骨侵袭模型评价体内抗肿瘤转移作用；免疫组化、Western blot和RT-PCR等技术研究其对细胞间黏附分子ICAM-1和P-或L-选择素表达的影响、对血管生成及相关因子表达的影响。本项目拟从结构层面理解其抗肿瘤转移作用，并探索合成结构明确、具有抗肿瘤转移作用的肝素寡糖并阐明其抗肿瘤转移机制。

肝素和硫酸乙酰肝素均为高度硫酸化的糖胺聚糖家族，是新型抗凝、抗肿瘤创新药物的重要先导化合物。而结构的高度复杂性和多样性导致其成为糖化学和糖药物最具挑战性的研究领域之一。课题组首先采用酶法实现了3种糖苷酸供体和硫酸基供体3’-磷酸腺苷-5’-腺苷磷酰硫酸（PAPS）克级规模的制备，产物纯度>95%，解决了化学酶法合成肝素寡糖的原料瓶颈。在此基础上，利用大肠杆菌重组表达的肝素糖链骨架合成酶、C5-异构化酶及硫酸基转移酶，结合简单的化学方法成功合成一系列不同异构化、硫酸化修饰的肝素寡糖，包括16种肝素骨架寡糖、7种NS-/6OS肝素三/四糖、21不同修饰模式的肝素五/六糖、16种长链复杂肝素寡糖（七糖~十糖），并完成全部寡糖化合物的结构表征；测定了肝素寡糖的抗凝活性及初步的体外抗肿瘤活性。同时，以合成的肝素寡糖为底物，利用蛋白质结晶、定点突变技术阐明了2-O-硫酸基转移酶独特的底物特异性及分子机制，有助于指导合成结构更加复杂多样的肝素寡糖。此外，探究了肝素酶对合成的肝素寡糖的主要和次要位点切割的差异性及可能的机制，对拓展肝素酶的应用范围具有重要的借鉴价值。总之，本研究发展了稳定、可靠的化学酶法策略合成肝素寡糖的技术体系，构建的多样化的化合物库将有助于阐明肝素寡糖与肿瘤靶蛋白相互作用的结构基础，促进基于肝素寡糖的高效低毒抗肿瘤转移创新药物的发现。