基于纤维素降解的牦牛瘤胃未培养微生物的功能研究

Yak (Bos grunniens) is a kind of ruminant living mainly in Qinghai-Tibetan Plateau. Most of the microbe in yak rumen belong to uncultured microorganisms. Previous work based on unculture approach in our lab determined that 57.1% of the bacterial species in a cellulose-degrading mix-culture were clustered to the not-yet-cultured groups, in which 3 uncultured groups were associated to cellulolytic bacteria. In order to detect the function of these 3 groups, probes were synthesized based on the cellulose binding domain(CBD) of cellulases and 16S rRNA sequences of these three groups. Fluorescence in situ hybridization (FISH) will be performed using RNA targeted and CBD targeted probes to examine the function of uncultured groups attached to cellulose. The plan of research are as follows: (1)16S rRNA gene library is to be constructed to analyze the uncultured microorganisms; (2) Real-time PCR will be applied to study the quantitation of uncultured groups in different time during cellulose degradation; (3) FISH will be used to determine whether the uncultured groups belong to cellulolytic microorganisms.

牦牛是生长在中国青藏高原地区的特有物种，其瘤胃中的微生物绝大部分属于未培养微生物，分子生态学方法可以揭示瘤胃微生物的组成和进化关系，不能确定未培养微生物的功能。前期工作发现，在降解纤维素的牦牛瘤胃微生物的混合培养物中，57.1%的原核生物属于未培养微生物，三个未培养微生物类群可能与纤维素降解相关。为进一步研究未培养微生物的功能，选择编码纤维素酶的纤维素结合结构域（CBD）保守序列的DNA片段作为探针，结合未培养微生物的16S rDNA探针与粘附在纤维素底物上的微生物进行荧光原位杂交，研究未培养微生物与纤维素降解的直接关系。研究内容包括：（1）构建16S rDNA文库确定混合培养物中的未培养微生物类群;（2）Real-time PCR研究在纤维素降解的不同时期未培养微生物的时间数量变化规律；（3）利用16S rDNA探针和CBD探针进行FISH确定具有纤维素降解功能的未培养微生物类群。

以牦牛瘤胃内容物为接种物，以滤纸为唯一碳源富集到一个降解纤维素的混合培养物。构建混合培养物的16S rRNA基因文库，共获得49个序列，分为7个OTU。其中19个序列与已培养细菌的16S rRNA 基因相似性>97%，占总序列的38.8%；2个古菌的序列与甲烷菌的16S rRNA 基因相似性分别为99%和98%，占总序列的4.1%；28个序列属于未培养细菌，占总序列的57.1%。未培养的序列形成4个独立的系统发育分支，其中3个未培养分支与在其他环境中的黏附在纤维素上的瘤胃细菌的16S rRNA基因序列相似性>97%，推测这3类微生物可能与纤维素降解相关。纤维素酶基因gcd825在大肠杆菌中表达，纯化回收重组蛋白并做酶学性质研究。SDS-PAGE显示该蛋白分子量为99kDa，可降解CMC（羧甲基纤维素）和果胶；重组蛋白Gcd825的两种酶比活力分别是28.24U/mg和15.88U/mg。45°C 时对羧甲基纤维素的Km为3.83mg/ml。蛋白Gcd825的最适pH是6，最适反应温度是45°C。在40°C、45°C保温6小时，酶活性保持在90%以上。在pH5.0-7.4 、40°C 1小时的酶活性保持60%以上。重组蛋白对纤维素有强烈的黏附作用。对分离获得的菌株进行多相分离研究，发现了2个新种，分别命名为Aeromicrobium camelliae sp. nov.和Pullulanibacillus pueri sp. nov.。