红茂草异紫堇碱促结核性伤口快速愈合分子机制研究

The Dicranostigma Leptopodum (Maxim.) Fedde was traditionally used to treat the active tuberculosis of lymph node and kinds of traumatic inflammation. Its active components are alkaloids, among which isocorydine is the highest-level constituents. It has been demonstrated that alkaloid extraction from Dicranostigma Leptopodum (Maxim.) Fedde is effective in anti-microbial, anti-tumor, liver-protection and immune-enhancing. This study aims to use the different dose of isocorydine extracted from the Dicranostigma Leptopodum (Maxim.) Fedde to test the drug sensitivity and related metabolic markers of Mycobacterium tuberculosis varieties, and effects of the extract on gene expression profile of drug sensitive strains will be analyzed using cDNA microarray. A rat tuberculosis infection model will be established for investigating the changes of wounded tissue collagens and cell growth factors in wound healing. The effects of isocorydine on cell proliferation, collagen synthesis, NO production, the mRNA levels of collagen, iNOS and growth factors, will be studied in cultured rat fibroblast. Effects of isocorydine on promoting wound healing will be assessed by measuring the mRNA levels of cytokines secreted by rat fibroblast cells. This study will provide the academic reference for the development and clinical applications of Dicranostigma Leptopodum (Maxim.) Fedde and a firm foundation for new drug development.

红茂草民间用于治疗开放性淋巴结核和各类创伤性炎症。有效成分为生物碱，其中以异紫堇碱的含量最高。已有的研究证明从红茂草提取的生物碱具有抑菌、保肝、抗肿瘤、增强免疫机能等功效。本项目拟采用红茂草异紫堇碱为材料，选择代表性结核分枝杆菌，通过与不同剂量红茂草异紫堇碱的作用，检测不同来源的结核分枝杆菌菌株对异紫堇碱的敏感性及相关代谢指标。利用表达谱芯片技术从全基因组水平评价对标准敏感株基因表达谱的影响。通过建立大鼠结核性伤口模型，检测对大鼠伤口组织胶原及伤口愈合相关细胞生长因子合成的影响。通过体外培养大鼠成纤维细胞，观察异紫堇碱对其增殖、胶原合成、NO产生及胶原、iNOS和生长因子的mRNA水平的影响。通过检测大鼠成纤维细胞分泌的细胞因子mRNA表达水平，探讨异紫堇碱在促进创伤愈合过程中的作用。本项目的研究，为红茂草的开发和临床应用提供理论参考，为新药研制做好基础工作。

本课题以红茂草异紫堇碱为材料，选择敏感性结核分枝杆菌，开展了结核菌抑菌试验、基因组与表达谱分析、结核菌所致伤口动物模型的建立及创伤修复过程中相关细胞因子的检测等方面的研究，探究了红茂草异紫堇碱在促进结核性创伤愈合过程中的作用，并进行了红茂草胶囊的中试生产和药学研究。结果表明：（1）牛分枝杆菌CVCC68002的基因组全长为4357100 bp，编码基因达4145 个，编码基因占全长的90.28%。分析红茂草生物碱作用下牛分枝杆菌的非靶向代谢组学及转录组学数据，证明在红茂草生物碱作用下，牛分枝杆菌基因上下调变化共有66 个基因，其中上调基因39 个，下调基因27 个，19 种显著性差异代谢物。（2）明晰了红茂草生物碱对结核分枝杆菌抑菌作用：异紫堇碱对牛分枝杆菌的MIC为400 μg/ml，IC50为183.02 ug/ml；抑制人分离型结核杆菌的MIC为200μg/ml，IC50为65.34 ug/ml，对耐药结核杆菌的MIC为400 μg/ml，IC50为87.52 ug/ml；扫描和透射电镜观察表明红茂草生物碱通过溶解牛分枝杆菌的细胞壁和细胞膜达到杀菌作用。（3）红茂草异紫堇碱可促进结核性伤口肉芽组织和成纤维细胞的生长，在异紫堇碱存在条件下，促炎因子 IL-1β、IL-6、PEG-2和 TNF- α 释放量都有不程度的降低，而抗炎因子IL-10 和NO 的释放量有不同程度的升高。（4）中试生产4批红茂草胶囊，急性毒性试验显示LD50=16.7136g/kg，亚慢性毒性试验不同剂量组的肝脏指数和肾脏指数具有显著性差异；体内药物动力学研究显示，给药组的药时曲线下面积（AUC）7002.312 mg/L•min，达峰浓度Cmax 13.3 mg/L，达峰时间Tmax 40 min，消除半衰期T1/2z 652.712 min。（5）制订了《红茂草规模化种植技术规范》和《红茂草生物总碱胶囊质量标准》两个企业标准。为新药生产和开发奠定了基础。