整合素β1-焦点黏着斑激酶促进角膜上皮损伤修复分子调控机制

The damage of corneal epithelium resulte in the neighboring cells migrate and adhere to control damage first, then the cells are activated to proliferation to repair the wound. We have found that: the appropriate changes in the microenvironment of corneal epithelial cells could promote the ability of cell proliferation through integrinβ1(adhesion, migration)- focus focal adhesion kinase (FAK) (adhesion, migration) -PI3K/AKT (proliferation) pathway. Accordingly, we hypothesize that the corneal epithelial damage activate the abilities of migration and adhesion just before the proliferation through the integrinβ1-FAK pathway. In this study, we would get the human corneal epithelial cells with the primary tissue culture. Then, after the integrinβ1 gene would be silenced， the phosphorylation of FAK be blocked. We would test the abilities of migration, adhesion and proliferation respectivel in the wound healing model. Molecular biology techniques would be used to test the expression changes of gene and protein. We would clarify the molecular mechanism of integrinβ1-FAK pathway in corneal epithelial wound repair and to explore the relationship of the process of adhesion and migration and proliferation. We would detecte the repaire mecahnism of corneal epithelium damage and provide a theoretical basis for new target of corneal epithelial damage repair.

角膜上皮损伤后，首先通过创面周边细胞移行与粘附控制损伤，然后才促进增殖修复创面。损伤迁延不愈可致角膜溃疡甚至穿孔。我们研究发现：角膜上皮细胞培养微环境的适当改变可以通过Integrinβ1（粘附、移行）-FAK（粘附、移行）-PI3K/AKT（增殖）途径激活细胞粘附及移行进而促进增殖。据此，我们推测角膜上皮损伤通过Integrinβ1-FAK途径首先激活上皮细胞移行与粘附，进而促进细胞增殖。本研究用小组织块培养法获得原代人角膜上皮细胞，分别沉默Integrinβ1基因，阻断FAK磷酸化，检测处理前后细胞在损伤模型中粘附和移行及增殖能力的改变。并用分子生物学技术进行通路相关基因及蛋白产物表达变化研究，旨在阐明Integrinβ1-FAK途径在角膜上皮损伤修复中的分子调控机制，探讨该过程中粘附和移行与增殖的关系，探讨修复机制，为角膜上皮损伤修复治疗新靶点的提出提供理论依据。

角膜是防御外界致病因子侵犯的第一道屏障。角膜上皮损伤后，快速有效愈合是维持正常视觉的基础，损伤修复延迟可导致角膜融解，甚至穿孔。因此阐明角膜上皮修复机制是重要研究方向。角膜上皮损伤后1小时之内相应部位上皮基底细胞表层桥粒连接和糖原储存减少；4-6小时伤口边缘上皮基底细胞开始移动。本研究在应用划痕实验验证角膜上皮损伤修复时发现：在开始4小时，上皮细胞移动极其活跃，当缺损处被填充后，细胞停止运动，进一步证实细胞移行是伤口愈合的起始环节。本研究应用小组织块培养法获得原代人角膜上皮细胞，划痕实验模仿角膜上皮损伤。发现划痕实验后前行速度快的细胞表达更多角膜缘干细胞表面标记（P53，ABCG2），提示移行能力可能是干细胞特性之一。沉默Integrinβ1基因后，细胞的粘附、移行及增殖能力均降低。细胞移行时首先在前段形成伪足并在整合素介导下与细胞外基质形成焦点黏着斑，细胞发生形变。随后，后端黏着斑解聚并与基质剥离，细胞向前移行，完成循环。细胞移行是协调有序的粘附和去粘附过程。Integrinβ1通路研究发现其在细胞表面的集簇表达能够使焦点黏着斑激酶（FAK）在黏着斑部位快速集中并发生自身酪氨酸磷酸化,激活下游的细胞迁移信号分子引发细胞变形、收缩和迁移。FAK是细胞迁移信号传导和整合的关键分子,其活化可能是整合素介导的信号传导相互作用的节点。本研究表明Intergrinβ1的沉默阻断了FAK磷酸化。伴随一系列FAK磷酸化的阻断可降低PI3K及Akt磷酸化，导致下游GSK-3磷酸化升高。因此，我们得出结论在角膜损伤修复中，角膜上皮细胞粘附、迁移的激活是增殖的前提和基础。同时，在小鼠在体研究中，我们初步发现角膜基质内的核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)在损伤后被激活。有研究结果表明NF-κB是GSK-3β的下游因子。这提示我们在角膜损伤修复的研究中角膜上皮提供细胞动力，而角膜基质是上皮细胞微环境的一个主要部分。共聚焦显微镜对角膜各层结构观察分析发现：角膜持续性上皮缺损患者角膜基底膜增厚，基底膜与上皮基底细胞之间的粘附性降低。因此本研究对于角膜上皮细胞微环境即角膜基质的研究提供了新思路。干眼是眼表微环境改变导致的慢性病程，而翼状胬肉手术导致的角膜缘干细胞缺失是研究眼表微环境改变的最好临床模型。本研究在进行信号通路基础研究的同时还对干眼患者眼表微环