人工合成多肽TRAP促进牙周组织再生的实验研究

Regeneration of periodontal tissues affected by chronic diseases comprises a major scientific and clinical challenge. The enamel matrix proteins (EMPs) have been successfully employed the regeneration of the three tooth-supporting tissues: alveolar bone, periodontal-ligament and cementum. Our previous studies suggested that the full-length amelogenin (Am) alone may be used to induce periodontal tissue regeneration. However, the full-length amelogenin tend to be digested, and the function of its proteolytically processed peptides have not been thoroughly investigated. Therefore, we hypothesized that the N terminal of full-length amelogenins, tyrosine-rich amelogenin peptide, is the functional region in the therapeutic effect of EMPs/Am-induced periodontal tissue healing and regeneration. This study will be carried out to express and synthesis a human tyrosine-rich amelogenin peptide(TRAP), and further compare the biological responses of human periodontal ligament cells(PDLC) to TRAP and Am. We will also characterized the molecular mechanisms involved in the related receptor and signaling pathways of PDLCs. Then, we will evaluate the therapeutic effect that TRAP alone induce in-vivo regeneration of all tooth-supporting tissues in a athymic mouse and dog model. Our data will aid in determining the clinical application of TRAP for periodontal would healing and regeneration.

釉基质蛋白(EMPs)能诱导促进牙周组织再生，因其来源受限及组分干扰等问题不利于临床药物的研发。近年发现EMPs的主要成分釉原蛋白(Am)是其诱导牙周组织再生的关键，可用于替代EMPs，但国内至今尚无此类药物。前期我们在国内首先建立了重组全长人Am表达体系，验证了其代替EMPs诱导牙周组织再生的能力。然而全长Am极易酶解稳定性差，各片段作用未明，因此我们希望找出Am功能活性区，研发低分子量Am生物活性多肽作为牙周再生药物。根据Am的来源及蛋白酶解规律，我们推测其诱导促进牙周组织再生的活性功能区位于氨基末端，即富酪氨酸釉原蛋白片段(TRAP)。因此本研究拟通过经典的体外细胞和动物体内实验评价人TRAP诱导促进牙周再生的作用，筛选其结合细胞发挥生物学作用的受体及信号通路，系统验证TRAP是Am诱导促进牙周再生的活性功能区的假说，为将来制备小分子生物活性多肽药物用于临床牙周再生治疗提供实验数据。

釉基质蛋白作为促进牙周组织再生的临床药物在国内尚无同类产品, 前期我们研究发现其主要成分釉原蛋白(Am)具有诱导牙周组织再生的能力，可用于替代EMPs。由于Am极易酶解稳定性差,各片段作用未明,因此本研究拟探讨Am功能活性区, 研发低分子量Am生物活性多肽作为牙周再生药物。本研究通过原核大肠杆菌表达体系结合亲和层析纯化制备Am及其低分子量肽段，并制备针对Am的单克隆抗体。利用经典的体外细胞和动物体内实验评价人TRAP诱导促进牙周再生的作用, 采用PCR array和免疫印迹法分析其发挥生物学作用的受体及信号通路，验证TRAP诱导促进牙周再生的假说。结果表明表达纯化的Am及TRAP等肽段均正确无误，所制备的单克隆抗体效价达到1∶729 000，识别人Am的45~149位氨基酸残基。重组TRAP能促进人牙周膜细胞迁移及成骨向分化。Am的氨基与羧基末端不参与蛋白被细胞内吞，而其中间肽段（45-149位氨基酸）可能与其内吞直接相关。重组TRAP影响细胞中Wnt、Hedgehog、NFkB等通路，并通过ERK1/2的磷酸化参与细胞有丝分裂的信号通路。动物体内实验发现重组TRAP促进人牙周膜细胞在根面粘附伸展和迁移，能够诱导形成类牙骨质，能够在骨缺损处诱导促进牙周组织再生。为研发釉原蛋白类临床药物提供实验数据，填补目前我国牙周生物制药领域亟需解决的空白，为将来制备小分子生物活性多肽药物用于临床牙周再生治疗奠定了基础。