c-Src激酶在2型糖尿病脑动脉BKCa通道功能障碍中的作用

大电导Ca2+激活钾通道（BKCa）在脑血管张力调节中起关键作用。预实验发现2型糖尿病（T2DM）大鼠脑动脉BKCa通道酪氨酸磷酸化水平增高与c-Src激酶激活有关。我们假设升高的胆固醇和AGEs激活c-Src激酶导致T2DM脑动脉BKCa通道酪氨酸磷酸化和功能障碍。本项目拟在GK大鼠、胆固醇和AGEs孵育的脑血管和平滑肌细胞及高表达BKCa通道不同亚单位的细胞系上，应用微血管张力、膜片钳和分子生物学技术，研究c-Src激酶对T2DM大鼠脑动脉和BKCa通道功能的影响、高胆固醇和AGEs在大鼠脑动脉c-Src激酶激活和BKCa通道功能障碍中的作用、BKCa通道α和β1亚单位被c-Src激酶磷酸化的酪氨酸位点及敲低c-Src激酶对T2DM大鼠脑动脉和BKCa通道功能障碍的影响。研究结果将阐明c-Src激酶在T2DM脑动脉BKCa通道功能障碍中的作用，为发展防治糖尿病缺血性中风的药物提供线索。

平滑肌大电导Ca2+激活钾离子通道（BKCa）由四个孔形成亚单位α和调节亚单位β1共同组成跨膜蛋白复合体。β1亚单位影响通道的Ca2+/电压敏感性、对药理学调节剂的反应以及通道向质膜的运输。在脑动脉平滑肌细胞，BKCa通道电流密度、对雌激素（作用于β1亚单位）的敏感性、β1亚单位在mRNA和蛋白水平的表达以及β1与α亚单位蛋白的比值均明显高于骨骼肌小动脉平滑肌细胞。提示β1亚单位可能在脑血管BKCa通道的调节中具有更为重要的意义。然而，脑血管BKCa通道的调节机制尚不完全清楚。本项目应用膜片钳与分子生物学等技术，通过离体和整体实验，取得以下重要结果：①表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶激活引起BKCa通道酪氨酸磷酸化，抑制通道功能，其作用呈β1亚单位依赖性。2型糖尿病（T2DM）时，大鼠或小鼠血管EGFR酪氨酸激酶活性增强，导致BKCa通道α和β1亚单位磷酸化水平增高，通道介导的血管舒张功能障碍，血管张力升高。本研究未获得c-Src酪氨酸激酶对脑血管BKCa通道调节的直接证据，可能是c-Src酪氨酸激酶对不同部位血管BKCa通道的调节具有异质性。②胆固醇通过增加通道蛋白的降解使KCa1.1通道蛋白表达降低，从而下调BKCa通道，β1-亚单位在这种调节中起关键作用。③雌马酚为大豆异黄酮在肠菌群作用下的代谢产物，通过作用于β1亚单位激活BKCa通道，舒张大鼠脑基底动脉，增加脑血流量。体内（0.625, 1.25 and 2.5 mg/kg, i.g. 连续 3天）或体外（10-9-10-5 mol/L）预防性给予雌马酚，可通过抑制缺血再灌注或缺氧再给氧引起的c-Src酪氨酸激酶活化，下调神经元2型NADPH氧化酶（gp91phox）的表达，对大鼠局灶性脑缺血再灌注或PC12细胞缺氧再给氧损伤产生保护作用。以上主要成果表明：增强的EGFR酪氨酸激酶活性在T2DM脑动脉BKCa通道功能障碍中起重要作用；胆固醇下调BKCa通道活性可能是伴高胆固醇血症的T2DM患者血管功能障碍的机制之一；雌马酚激活BKCa通道等有益作用使其有望发展成为防治糖尿病缺血性中风的药物。