APOBEC3G抗HCV的新分子机制研究

我们在以宿主细胞蛋白作为抗病毒药物靶点的理论与实践系列研究中，首次发现并证实宿主细胞因子载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G（APOBEC3G）是丙型肝炎病毒（HCV）复制的限制性因子，且化学小分子化合物能直接稳定其在胞内的水平从而达到抗HCV的作用；尽管APOBEC3G被包装至感染性子代病毒颗粒中并发挥作用，但其抗HCV活性与其引起病毒基因脱氨发生G→A超突变无关（Hepatology，2011，IF=10.84）；由于HCV（黄病毒科）复制周期与逆转录病毒科、嗜肝DNA病毒科和细小DNA病毒科等病毒复制过程明显不同，因此提示APOBEC3G有新的抗病毒作用机制。本课题即在现有原创性研究成果基础上深入分析APOBEC3G结构与其抗HCV的功能关系及HCV拮抗其限制作用基础，以阐明APOBEC3G抗HCV的新分子机制，旨在丰富抗病毒理论的同时，还为研发新型抗HCV药物提供科学依据。

本项目是在我们以往发现APOBEC3G(hA3G)具有不依赖于其脱氨基抗病毒作用方式限制HCV复制的作用，且化学小分子化合物能直接稳定胞内hA3G水平从而达到抗病毒作用的基础上，深入分析hA3G抗HCV复制的新分子作用机制。.首先通过用免疫共沉淀、Western Blot和多肽测序等方法获得并确证与hA3G蛋白直接或间接结合的HCV成分NS3蛋白，并通过反向免疫共沉淀进一步验证了这种结合；通过免疫荧光染色法确证了hA3G与NS3蛋白在胞内的共定位，同时用BIAcore技术证实hA3G与NS3蛋白的直接结合；应用同源建模和蛋白对接分析也进一步指证hA3G与NS3蛋白存在直接相互作用，应用高表达技术并利用亲和层析法和WB实验验证hA3G的C端能与NS3蛋白结合，而hA3G的N端不与NS3蛋白结合。其次通过体外酶活性分析，发现hA3G与NS3蛋白相互作用后，hA3G的结合可能影响了NS3蛋白构象从而降低了NS3蛋白解旋酶活性，但这种改变对NS3蛋白的丝氨酸蛋白酶和NTPase没有影响；应用共转染实验也进一步说明hA3G对HCV复制的限制性作用是通过作用于HCV NS3蛋白实现的。实验发现HCV病毒急性感染导致细胞内hA3G的升高，可能NS3/4A的高表达有关，显示机体通过上述机制有利于清除病毒，但病毒也有逃避这种免疫机制，因为长期感染胞内hA3G水平已降低，这种相互作用有待深入分析。上述这些结果说明hA3G是通过与NS3结合导致NS3蛋白构象改变，影响其解旋酶活性，从而阻止病毒复制。此致，本项目阐明了hA3G抗HCV的新分子作用机制。由于hA3G是新发现的HCV限制性因子，相对于其它抗病毒药物靶点，其在抗HCV中是否具有优势仍需实验分析。我们首先用分子对接再应用生物学实验验证，显示了hA3G作为小分子化合物稳定剂靶点在抗HCV作用上具有明显优点，即具有泛基因型的和家族内协同的抗HCV作用。.本项目从分子水平上探讨了hA3G限制HCV复制的新分子机制，丰富和完善了hA3G的抗病毒理论；APOBEC3s对HCV不同亚型NS3解旋酶活性具有不同程度地抑制作用，具有泛基因型的抗HCV作用，另外还提示了APOBEC3家族成员具有协同的抗HCV作用效果。相关研究成果在丰富抗病毒理论的同时，在基础研究上补充阐明了HCV复制机制，在应用研究上为未来研发新型抗HCV药物提供了科学依据。