Cell-in-cell结构在肝癌免疫逃逸中的作用及其机制研究

In recent years, it has been shown that tumor cells can internalize and kill the immune killer cells via the formation of heterotypic "cell-in-cell" structure (emperitosis). However, there is no clear evidence to confirm that this process can promote tumor immune escape. In this study, based on the well-established emperitosis cell model, we intend to screen the cell lines with different cell-in-cell formation ability in human hepatocellular carcinoma cells by monoclonal analysis, and explore whether hepatocellular carcinoma cells can use cell-in-cell structure to clear immune killer cells and establish immune tolerance, and then to achieve the purpose of immune escape during the occurrence and development of hepatocellular carcinoma. Furthermore, key molecular switches and signaling pathways regulating the formation of cell-in-cell in hepatocellular carcinoma cells are screened by using gene expression profiling, and further mechanism are revealed by using dynamic microscopic imaging technology. Finally, revealing the relationship among cell-in-cell structure, immune escape and the occurrence and development of hepatocellular carcinoma, thus to provide new strategies and targets for the treatment of hepatocellular carcinoma.

近年来的研究显示，肿瘤细胞能够通过形成“cell-in-cell”结构内化并杀死免疫杀伤细胞（emperitosis），而该过程是否能够促进肿瘤免疫逃逸，目前仍缺乏实验证据。本研究中，基于现有成熟的emperitosis细胞模型，我们拟通过单克隆分析法筛选人肝癌细胞中具有不同cell-in-cell形成能力的细胞株，探讨肝癌细胞是否可以利用cell-in-cell结构清除免疫细胞建立免疫耐受，进而达到免疫逃逸的目的；然后结合表达谱分析筛选肝细胞癌细胞中调控cell-in-cell形成的关键分子开关和信号通路，进一步利用现代化的动态显微成像等技术研究其影响cell-in-cell形成和免疫耐受的细胞生物学机制，最终建立cell-in-cell结构与免疫逃逸促进肝癌发生发展的联系，从而为靶向该机制治疗肝癌提供新的策略和靶点。

本研究基于现有成熟的emperitosis细胞模型，通过单克隆分析筛选方法，成功由PLC/PRF/5细胞筛选得到一系列异质型细胞叠套结构（heterotypic cell-in-cell structure，heCICs）形成能力不同的单克隆细胞系。进一步通过表达谱分析筛选得到一系列调控heCICs结构形成的关键分子，并揭示部分分子的调控机制，以及heCICs在肿瘤免疫中的调控功能。本研究发现了一种heCICs介导的免疫细胞胞内杀伤新方式，为靶向heCICs发展新型肿瘤免疫治疗提供策略和靶点。发表标注SCI论文9篇，中文期刊论文1篇，合计影响＞106，其中影响因子>10的论文共3篇，5<影响因子<10的论文共6篇，超额完成设定目标。.肿瘤组织是一个高度动态的异质性组织，多项研究显示肿瘤细胞可以内化免疫细胞形成heCICs，而该过程对肿瘤免疫的调控机制和功能有待进一步解析。本研究的目的是基于现有成熟的emperitosis细胞模型，通过单克隆分析法筛选人肝癌细胞中heCICs形成能力差异的细胞株，解析heCICs在肝癌免疫过程中的功能；同时结合表达谱分析筛选肝癌细胞中调控heCICs形成的关键分子开关和信号通路，最终建立heCICs与肝癌发生发展的联系，为靶向该机制治疗肝癌提供新的策略和靶点。研究结果表明：（1）成功筛选得到74株heCICs形成能力差异显著的PLC/PRF/5单克隆细胞株；（2）heCICs结构介导一种全新的免疫杀伤模式，即免疫细胞通过钻入肝癌细胞形成heCICs从内部杀伤肿瘤细胞，这种胞内杀伤（in-cell killing）方式具有比传统胞外杀伤（kiss-killing）更强的杀伤活性（~8倍）；（3）通过对heCICs结构形成能力不同的单克隆细胞株进行表达谱分析，筛选得到一系列调控heCICs形成的基因，发现肿瘤细胞上的CD44抑制heCICs形成，是胞内杀伤的负调节因子；（4）CD44通过抑制N-cadherin介导的细胞间粘附和增强Rho-GTPase调节的细胞硬度进而抑制heCICs形成；（5）抗体介导CD44信号通路阻断显著增强NK细胞通过heCICs结构形成对肿瘤生长的抑制作用。综上，heCICs介导的“细胞内杀伤”有望成为一种新型的肿瘤免疫治疗策略。.