利用人源肺癌裸鼠移植瘤模型结合蛋白质组学技术发现新的肺癌血液蛋白标志物的研究

The mortality rate of lung cancer ranks the top place in all kinds of malignant tumour. The specificity and sensitivity of current plasma biomarkers used for clinical diagnosis are not ideal, an efficient biomarker is needed to assist diagnosis. This study analyzed the blood plasma in nude mice xenografted with human lung cancer tissues, using proteomics profiling method. This new approach greatly increased the chance of discovering proteins of low abundance, which are released from lung tumours. We have successfully established xenografts of human lung cancer in nude mice, and analyzed the level of SCC and Cyfra21-1 in 49 blood samples. We selected 17 samples with the highest level of SCC and Cyfra 21-1 and carried out gel electrophoresis, mass spectrometry, combined with bioinformatics analysis that removed all mice proteins. We then searched the database and screened the potential screening molecules that could possibly used in ELISA. Early stage optimization was carried out using 100 patients blood samples versus 100 samples from healthy population. It was then scaled up to 1000 patient blood samples versus 500 healthy population, to evaluate the specificity and sensitivity of selected markers. After establishing 1-2 lead protein markers in lung cancer diagnosis, we analyzed of the relationship between the plasma levels and patient staging and survival; we further analyzed of the change of levels of markers in recurrence patients. Using above strategy and method, this research aims to find 1-2 new 1-2 protein molecules in blood for diagnosis of lung cancer and to monitor recurrence of cancer.

肺癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首。目前临床常用的血液分子标志物敏感度和特异性都不理想，急需发现新的高效辅助诊断标志物。本研究设计了利用人源肺癌组织裸鼠移植模型血浆进行蛋白质组学检测的策略，这种新的研究策略使发现肺癌释放的低丰度蛋白的可能性大大增加。我们已经成功建立了人源肺癌组织裸鼠移植瘤，并检测了49例血浆中SCC、Cyfra21-1的水平。在本研究中，将选取水平最高的17例血浆等体积混合后进行凝胶电泳和质谱分析，生物信息学分析去除老鼠蛋白，进行数据库查询筛选出能进行ELISA检测的分子。进行200肺癌对100健康人血浆前期优化检测；再扩大至1000肺癌对500健康人中验证，评价其诊断的敏感性和特异性；确定1-2个新的肺癌诊断蛋白标志物，分析其血浆水平与病人分期、预后的关系；进一步分析其在术后及复发病人中的变化。通过上述研究策略和方案发现1-2个新的用于肺癌诊断和监测的血液分子标志物。

目前肺癌肿瘤标志物的研究仍极具挑战性，人类血液样本的复杂性、多样性和潜在标志物浓度过低构成了标志物研究的主要障碍。但蛋白质组学技术的发展和裸鼠移植瘤模型的应用为发现新的标志物提供了契机。本研究的目的在于将这两种技术联合应用，以期发现新的肿瘤标志物用于肺癌的诊断。发现裸鼠移植瘤与相应原发瘤的病理形态学表现一致。比较人体血浆与裸鼠模型血浆中SCC-antigen、Cyfra21-1的水平，两者在裸鼠血浆中的平均浓度分别提高了15倍和37倍。17例裸鼠血浆等体积混合后行蛋白质组学分析，共发现了580条人类来源的蛋白，其中45条为双/多肽定位的蛋白。PAK4在215例NSCLC患者血浆中的浓度明显高于128例健康对照者，其ROC（receiver operating characteristic curve）曲线下面积（AUC）达0.766，敏感性、特异性和最大Youden指数分别为61.86%、86.72%和0.49，与CEA的AUC值(0.722)相近（p=0.235），但差于Cyfra21-1的0.841（p=0.019）。当PAK4+Cyfra21-1+CEA组合时，其AUC达0.922，敏感性、特异性和最大Youden指数分别为87.91%、83.59%、0.72，明显优于Cyfra21-1+CEA的组合，其AUC值、敏感性、特异性和最大Youden指数分别为0.869，69.30%、90.62%和0.60（p＜0.001）。此外，PAK4在NSCLC肿瘤组织中阳性表达率显著高于癌旁正常组织（81.2% vs 11.0%，p＜0.001），并与预后显著相关，可作为判断NSCLC预后的独立因素（p=0.019, HR 1.541, 95% CI 1.073-2.211）。人源肿瘤裸鼠移植瘤模型联合蛋白质组学技术更适合肿瘤标志物的研究，提高了低丰度蛋白的发现几率。PAK4有可能作为新的蛋白标志物用于NSCLC的诊断，尤其是与已有标志物联合应用时能获得更好的诊断效能。此外，PAK4在肿瘤组织中的表达强度还与NSCLC患者的长期生存有相关性，可作为预测NSCLC预后的标志物。.