经门静脉注射VEGF165抑制肝硬化大鼠肝窦毛细血管化的研究

Sinusoidal capillarization refers to the loss of fenestrae of sinusoidal endothelial cells and basement membrane formation, which will lead to the exchange of substances between hepatocytes and sinusoidal blood disorder, lead to cirrhosis finally. Vascular endothelial growth factor (VEGF) has been shown to promote endothelial cell fenestrae formation and to increase endothelial cell permeability. Theoretically VEGF increase the exchange of substances between the liver sinusoidal and liver cells by the above-mentioned functions, thereby reducing sinusoidal capillarization, inhibition of cirrhosis of the liver. First,Laboratory personnel will establish the thioacetamide induced cirrhotic rat model and infuse different concentrations of VEGF165 by the Alzet capsule osmotic pump via the portal vein. Sinusoidal endothelial cell fenestrae and basement membrane changes will be observed by transmission electron microscopy.Immune electron microscopy will be used to find the expression of CD44 in liver sinusoidal endothelial cell. Serum hyaluronic acid content will be detected by Elisa.Automatic biochemical analyzer will be used to detect serum transaminases, lipids, bilirubin.All the above will confirm the function of VEGF165 in the treatment of hepatic sinusoidal capillarization and cirrhosis.Furthermore,the best treatment concentration and time will be determinded. Second, in the normal sinusoidal endothelial cells in vitro VEGF165, the formation of fenestrae and the change of endothelial permeability will be explained by observing the cytoskeleton.

肝窦毛细血管化是指肝窦内皮细胞的失窗孔和基底膜形成，这将导致肝细胞和肝窦血液之间的物质交换障碍，是导致肝硬化的主要因素。血管内皮生长因子VEGF已被证实可促进内皮细胞窗孔形成，增加内皮细胞通透性。因此理论上VEGF可以通过上述功能增加肝窦与肝细胞之间物质交换，从而减轻肝窦毛细血管化，抑制肝硬化。本实验将首先建立硫代乙酰胺诱导的肝硬化大鼠模型，使用Alzet胶囊渗透压泵经门静脉持续泵入不同浓度的VEGF165。通过透射电镜观察肝窦内皮细胞窗孔及基底膜的变化，免疫电镜观察肝窦内皮细胞CD44的表达，Elisa测定血清透明质酸含量，全自动生化分析仪测定血清转氨酶、血脂、胆红素的变化来证实VEGF165抑制肝窦毛细血管化，治疗肝硬化的作用，并确定最佳治疗浓度及时间。其次在体外培养的正常肝窦内皮细胞中加入VEGF165，通过观察细胞骨架的变化，解释VEGF165诱导窗孔形成及内皮渗透性改变的机制。

我国每年因肝硬化死亡的人数超过30万，延缓或逆转肝硬化是医疗界不懈追求的目标。肝硬化的原因多样，但共有的一点是肝窦内皮细胞（LSECs）的失窗孔和基底膜形成，肝细胞与肝窦间物质交换发生障碍，加重肝细胞损害。因此窦内皮细胞毛细血管化可能是导致肝硬化的重要因素。.VEGF已被证实可维持LSECs正常表型，但多项研究表明VEGF对肝硬化有加重作用。然而，也有报道认为VEGF是有益因素。VEGF在肝硬化进展和恢复中的作用及机制存在较大争议。.本课题使用微量泵经下腔静脉持续泵入VEGF165的方法，将肝硬化大鼠给予不同剂量和时间的VEGF，进行肝功能及胶原纤维含量测定以及透射电镜下肝脏超微结构的观察；培养正常及硫代乙酰胺处理后的VEGF165不同浓度梯度处理的LSECs，经鬼笔环肽染色观察细胞骨架，扫描电镜观察窗孔。我们发现，随着VEGF治疗剂量和时间的增加，肝脏功能（ALT、AST）及肝脏纤维化程度（Masson染色及羟脯胺酸含量测定）明显的改善；LSECs功能得到恢复（vWF下降、CD44升高）；透射电镜下LSECs结构和功能趋于正常（基底膜变薄消失、窗孔重新形成、吞噬小泡增多）、肝细胞结构趋于正常（线粒体膜清晰无明显水肿、微绒毛重现等）。细胞实验亦证实,硫代乙酰胺可以使肌丝紊乱、窗孔减少，而VEGF165可以使硫代乙酰胺干扰后的LSECs肌丝恢复、窗孔重开。综上所述，我们认为VEGF165可以通过改善LSECs细胞结构和生理功能促进肝硬化的恢复。.我们的前期实验证实，VEGF质粒转染肝硬化大鼠肝脏可抑制肝硬化。但活体转染效率低，效果不稳定。本课题中，我们使用微量泵腔静脉泵入这一新型的方法，保证了药物作用的稳定性。VEGF在肝硬化的作用存在争议，结合本课题的数据结果，我们认为VEGF可以通过促进LSECs结构及功能的恢复改善肝脏细胞的物质交换，从而加速肝硬化恢复，这也解释了为何在不停用肝硬化诱导药物的情况下VEGF能加快肝硬化进展，这一发现可为VEGF在肝硬化作用的研究上提供新的研究思路，为肝硬化的治疗提供潜在的作用靶点。