苜蓿叶绿体高效表达无抗生素标记猪瘟饲用疫苗及免疫活性研究

Classical swine fever virus (CSFV) is the causative agent of classical swine fever (CSF) and could cause severe disease and economical loss to swine industry. Vaccination is an effective and economic strategy in controlling CSFV. The study will establish an efficient chloroplast gene transformation system in alfalfa (Medicago sativa L.) with non-antibiotic resistance election marker BADH gene and expression of E2 gene of CSFV，and obtain recombinant classical swine fever vaccine. Main contents Include: establishment of an stable alfalfa chloroplast transformation system, cloning homologous recombination sequences form alfalfa chloroplast genome, construction of site-specific integration vector of chloroplast transformation of alfalfa genome, chloroplast transformation, homogeneity selecting of alfalfa transformants, phenotype analysis of plant transformants, Western blot analysis of E2 protein in transformants and animal immune experiments. Alfalfa is a kind of ideal carrier for production edible plant vaccines，therefore，establishment of alfalfa chloroplast transformation system and expression of classical swine fever plant vaccine is very important for swine industry.

本研究拟用植物来源的甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因为筛选标记基因，用基因枪方法将猪瘟病毒石门强毒株主要抗原E2编码基因导入紫花苜蓿叶绿体基因组中表达，获得稳定的叶绿体转化植株，并期望获得没有抗生素抗性基因标记的有免疫活性的猪瘟饲用疫苗。内容包括：建立稳定的苜蓿叶绿体遗传转化体系；叶绿体基因组同源重组片段的克隆；叶绿体转化载体质粒的构建；叶绿体转化；对获得的转基因植株进行同质化筛选及分子鉴定；对转基因植株的后代表型进行分析；对叶绿体表达的E2蛋白免疫诱导活性进行分析以及进行动物免疫试验。紫花苜蓿素有“牧草之王”之称，是一种理想的动物口服疫苗生产载体，植物细胞壁对细胞内的抗原提供保护从而避免抗原在消化道中的降解，所以动物可以直接食用牧草进行免疫。因此研究用苜蓿叶绿体高效表达E2蛋白，建立苜蓿叶绿体高效表达表达体系，探索 一条安全、有效、廉价的动物疫苗生产新途径,为我国畜牧业发展服务。

猪瘟和猪圆环病是两类对养猪业危害性极大的动物烈性传染病，每年都对中国和世界养猪业造成巨大的经济损失。本研究构建了一系列植物叶绿体和核转化载体，将猪瘟病毒主要抗原E2基因和猪圆环病毒主要抗原ORF2基因在植物叶绿体和核基因组中表达，探索表达重要动物医用蛋白的新途径。本研究根据烟草（Nicotiana tabacum）叶绿体基因组密码子的表达偏好性优化合成了猪圆环病毒2型主要抗原基因ORF2，选择来源于烟草叶绿体基因的融合启动子PrrnPclpPrbcL和终止子TpsbA为外源基因调控序列，烟草叶绿体基因16S-trnI-trnA-23S为同源重组序列，构建了含有ORF2抗原基因的烟草叶绿体表达载体pNK-a03。通过基因枪法将表达载体pNK-a03导入烟草叶绿体中，抗性筛选后得到21株抗性烟草植株。PCR检测结果表明有3株抗性植株的PCR产物中出现了ORF2外源基因的目的条带；通过PCR、RT-PCR、SDS-PAGE、Western-blot和ELISA技术检测，结果证实ORF2抗原基因在烟草叶绿体中实现了有效整合、转录和表达，且重组蛋白具有一定的免疫反应性；本研究还构建了含有人工优化合成的猪圆环病毒2型主要抗原基因ORF2和aadA抗性基因的莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）叶绿体表达载体pCR02。通过基因枪转化法将表达载体pCR02导入衣藻叶绿体中，抗性筛选后共获得13个抗性衣藻转化子。通过PCR、RT-PCR、SDS-PAGE、Western-blot和ELISA分子生物学检测表明ORF2抗原基因在衣藻叶绿体内得到了有效转录和表达，并具有一定的免疫反应性；本研究将E2抗原基因和马铃薯特异性调控序列组合，构建了E2抗原基因马铃薯核表达载体并经农杆菌侵染导入马铃薯中表达。通过抗性筛选、PCR扩增、Southern-blot、Western-blot和ELISA检测分析，结果显示E2抗原基因整合进入马铃薯基因组中，且E2抗原蛋白得到了有效表达，表达量约占细胞可溶性总蛋白的1.1%-1.5%。这些实验结果表明植物叶绿体和核基因组可作为重要重组医药蛋白表达平台，为拓宽重组药物蛋白的表达途径提供了重要实验依据。