基于宏基因组高通量测序的刺参消化道微生物功能研究

刺参自古是补益佳品，近年来研究证实刺参体内具有多种对人体有益的生物活性物质，笔者推测共附生微生物可能是其生物活性物质的重要来源。消化道是刺参共附生微生物的主要栖居地，全面揭示刺参消化道微生物的功能是查明刺参生物活性物质来源的关键。由于传统分离培养方法能够研究的微生物比例极低，制约了相关研究的开展，而宏基因组学方法将可培养和未培养微生物的基因组纳入研究范畴，是目前研究环境微生物功能、发现生物活性物质功能基因的有效手段。本项目拟从微生物多样性较高的刺参后肠内含物提取总DNA，构建刺参消化道微生物宏基因组测序文库，利用高通量测序平台获得共附生微生物宏基因组序列，通过生物信息学分析进行物种注释和基因预测，全面揭示刺参消化道微生物种类和功能。预期研究结果将为深入探索刺参与共附生微生物的关系、开发刺参生物活性物质提供数据支持。

本项目采用宏基因组技术，对刺参消化道微生物群落结构及其功能进行了研究。1）利用16S rDNA高通量测序技术，较全面的揭示了刺参消化道及其栖息地沉积物细菌群落组成。刺参栖息地沉积物、前肠和后肠内含物的细菌包含38±5，31±6和28±7个门。变形菌门是刺参消化道和栖息地沉积物中最优势的门，前肠、后肠以及沉积物中的优势纲分别为全噬菌纲和γ-变形菌纲、γ-变形菌纲和δ-变形菌纲、γ-变形菌纲和δ-变形菌纲。在刺参肠道中发现了芽孢杆菌属、乳酸菌以及假单胞菌属等潜在益生菌的存在。主成分分析和Heatmap图显示刺参前肠、后肠及周围沉积物具有不同的细菌组成，推测刺参的选择性摄食是导致刺参前肠内含物和周围沉积物中细菌组成不同的主要原因。2）构建了刺参消化道微生物宏基因组测序文库，得到了53.07G的原始数据，对原始数据进行预处理后得到48.86G的有效数据。使用SOAPdenovo组装软件对预处理后得到的有效数据进行组装分析，选取组装结果中不小于 300bp的Scaftigs数据，使用MetaGeneMark软件进行基因预测。将基因预测结果与NCBI的NT数据库中抽提出的细菌、真菌、古菌和病毒数据进行BLAST比对，得到物种注释信息，共得到37个门的物种注释信息。基于预测基因的蛋白序列，通过与不同功能的注释数据库（KEGG、eggNOG 和CAZy）进行蛋白序列BLAST 比对进行功能注释。功能注释结果表明，刺参消化道微生物与新陈代谢相关的基因数目最多，其次是遗传信息处理的基因和环境信息处理相关基因；刺参消化道微生物中含有大量的碳水化合物酶相关基因：其中糖苷水解酶（GHs）2721个基因，糖基转移酶（GTs）2719个基因，碳水化合物结合模块（CBMs）1081个基因，碳水化合物酯酶（CEs）422个基因，多糖裂合酶（PLs）131个基因。3) 从健康刺参消化道分离筛选到39株产消化酶微生物，16S rDNA测序表明所有的微生物归属为芽孢杆菌属（Bacillus）和枝芽胞菌属（Virgibacillus），对筛选得到的产酶菌株产生的胞外蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活性进行了测定，并对其抑菌活性进行了分析，得到3株产蛋白酶活性、淀粉酶活性和纤维素酶活性最强的菌株，1株对灿烂弧菌具有最强的抑菌活性的菌株。