Pseudomonas sp.IM-4降解咪草烟分子机理的研究

近年来，除草剂咪草烟的大量使用污染农田土壤并对后茬作物造成严重药害。咪草烟在土壤中的残留动态过程与土壤微生物密切相关，了解微生物在这一过程中的作用对于受污土壤的生物修复具有重要意义。目前对咪草烟微生物降解的研究还很不充分，对许多基本的问题如微生物降解的代谢途径、参与降解的酶等仍不清楚。申请者分离获得了能高效降解咪草烟的假单胞菌IM-4菌株，降解谱广，降解性状优良。本项目以IM-4菌株为研究对象，分析其降解咪草烟的中间代谢产物、建立代谢途径；克隆咪草烟微生物降解关键酶基因；表达和纯化所获得的关键酶基因，研究酶学特性。通过本项目的实施可以深入了解咪草烟微生物降解的分子机理，进而为咪草烟污染土壤的生物修复提供新的资源和思路。

在已有咪草烟降解菌Pseudomonas sp.IM-4的基础上，继续开展降解菌株的分离工作。从长期施用咪草烟的农田土壤中分离到以共代谢的方式降解咪草烟的菌株Bacillus sp. QC-13。从咪草烟污染的土壤中分离了Terrimonas terrae等除草剂降解菌，并鉴定为新种。研究了咪草烟微生物降解的中间产物，发现IM-4 降解咪草烟的途径是咪唑啉酮环侧链脱去1分子甲基，生成5-乙基-2-(4-异丙基--5-氧代-2-咪唑啉-2-基)烟酸，同时也发现羧基被甲酯化，生成5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)烟酸甲酯。鉴定了QC-13降解咪草烟的中间代谢产物，发现咪草烟脱去1分子羧基，生成2-(5-乙基吡啶-2-基)-4-异丙基-4-甲基-1氢-咪唑-5(4氢)-酮，随后咪唑啉酮环侧链异丙基被降解，生成2-(5-乙基吡啶-2-基)-4-甲基-1H-咪唑-5(4氢)-酮。利用转座子插入法克隆IM-4降解咪草烟的相关基因，发现IM-4的ALS基因与降解相关。克隆了IM-4的ALS基因ilvBH，发现IM-4的ilvH的氨基酸序列与模式菌株相比较没有差异，而IM-4的ilvB的氨基酸序列与模式菌株相比较有3个氨基酸位点的差异。IM-4在系列浓度咪草烟平板上的生长特性与ALS的酶学特性研究结果表明，ilvB基因3个氨基酸位点的差异导致了IM-4对于咪草烟产生了抗性，而该抗性的产生是IM-4降解咪草烟的前提条件。对于IM-4的ilvBH进行了表达与纯化，研究了酶学特性与动力学参数。研究了咪草烟污染土壤的微生物修复作用与残留药害的解除，发现接种IM-4可以有效降解土壤中的咪草烟残留，并可缓解土壤中咪草烟残留对敏感作物玉米的药害。