基于ERα/ERβ/GPER介导分子通路探究四物汤补血调经的最佳配比规律及其分子机制

Chinese medicinal formulae plays important roles in clinical treatment by TCM. In order to reveal the target point and molecular pathway of the decoction and explore its compatibility law which are key problems and hot issues need to be solved in TCM research, modern pharmacological techniques majoring at integral, cellular and molecular levels will be employed in the research. Siwu decoction has been applied widely and effectively in treating gynecological disease by nourishing blood and regulating menstruation. But till now there has been no systematic report on the pharmacological mechanism and compatibility law of Siwu targeting specific subtype of ER and its related signal transductive molecular pathway. In the current research, the above issue will be studied by both in vitro and in vivo experiments, mainly by focusing on the inductive and regulative function of the three core target points of Siwu including ERα, ERβ and GPER towards downstream estrogen effective gene expression in the target organs, such as uterus, cardiovasalar system and bone. Techniques including gene silence and plasmid transfection will be employed to analyze the estrogenic function and its molecular mechanism of Siwu by detecting expression level of the estrogen targeting genes via downstream PI3K/AKT and MAPK/ERK molecular pathway. The interrelation among the pathway via different estrogen receptor subtypes in realizing Siwu's therapeutic effects will also be analyzed. The results will contribute to provide important theoretic basis and experimental evidence for the rational and effective medication in clinical application of Siwu decoction.

中药方剂是中医临床治疗的主要手段，应用现代药理学实验方法从整体、细胞、分子水平系统、深入地阐释方剂的作用靶点和分子通路，探究其最佳配比规律是方剂研究的焦点和热点问题。四物汤在临床治疗妇科疾病、补血调经方面有着长期、广泛的应用和确凿的疗效，但从靶向不同亚型雌激素受体及其信号传导分子通路入手系统探究其配比规律和作用机理的研究尚未见报道。本课题利用整体动物结合体外细胞培养实验，从四物汤在子宫、心血管、骨骼等靶部位发挥作用的核心靶点——雌激素受体三种亚型：ERα、ERβ和GPER对下游雌激素效应基因表达的介导和调控途径入手，结合基因沉默、质粒转染等技术分析四物汤以下游PI3K/AKT及MAPK/ERK途径为主要分子通路，影响雌激素靶向基因表达的雌激素样效应及其分子机理；并揭示不同ER亚型在介导四物汤发挥疗效过程中的相互关系。研究结果将为四物汤在妇科临床的合理、有效用药提供重要理论基础和实验依据。

本课题以在中医妇科临床应用历史悠久的经典方剂四物汤为研究对象，综合运用多种现代药理学检测方法和技术，旨在从整体、细胞、分子等多个水平，探究其发挥雌激素样效应、补血调经的最佳配比规律，深入阐释四物汤在妇科临床应用中的作用靶点和分子通路，特别是以其对代表性靶向组织和细胞不同亚型雌激素受体（ER）表达水平和比例的调节效应为核心，揭示其经特异性ER亚型综合介导的信号传导通路发挥雌激素样效应的机理为研究重点。在体实验研究中，首先通过正交实验检测了四物汤补血调经的最佳配比规律及其基于ERα/ERβ/GPER调节和介导的分子作用机制；结果发现，针对动物子宫系数、血清雌激素、孕激素、卵泡刺激素等指标水平升高作用显著的四物汤组方最佳配比有所差异，提示临床用药时应根据患者的具体情况综合考虑，有针对性地配比用药。同时，检测了四物汤对雌激素代表性靶器官——子宫、主动脉、股骨、海马ER亚型和相关信号通路关键调节因子表达的调控作用，实验结果为临床不同基础雌激素分泌水平的患者的用药提供了重要参考。体外实验研究中，分别以原代培养的大鼠成骨细胞和MC3T3-E1成骨细胞、EC-304血管内皮细胞、PC-12神经细胞为研究对象，深入分析了四物汤对雌激素代表性靶向细胞的雌激素样效应，与在体实验一致，四物汤也显示了对靶细胞ERα、ERβ和GPER表达水平和比例的调节功能，并可通过特异性ER亚型介导的胞内信号传导通路：EGFR /PI3K/AKT和MAPK/ERK1/2分子途径发挥雌激素样效应。研究中使用了多种ER亚型调节剂、相关传导通路关键因子激活剂或抑制剂，应用了质粒转染、基因沉默等技术手段，对四物汤发挥效应的分子通路进行了进一步的深入分析和验证。此外，在课题原定研究内容的基础上，还进行了四物汤对血管平滑肌细胞雌激素样效应的检测，并与其对乳腺癌细胞的作用进行了对比分析，为指导方剂的妇科临床应用提供了更加全面的实验依据和理论参考。