玉米B染色体显微分离及其DNA文库构建研究

B chromosomes in cells, morphologically distinct from standard chromosomes (A chromosomes), are a puzzle in chromosomal inheritance. In this study, chromosome preparation are used to observe, identify, and locate B chromosomes in maize landraces. Their genomic DNA will be amplified in vitro using ligation mediated PCR (LA-PCR) and degenerate PCR (DOP-PCR) after B chromosomes are isolated, based on the chromosome microisolation technique. The amplified DNA fragments, from isolation, purification, and southern hybridization, are ligated to plasmid vector, and then transformed into competent cells of E. coli. The positive identification and agarose gel electrophoresis are carried out to pick out the positive clones in transformation products. With the positive clones selected, a genomic DNA library of B chromosomes in maize landraces is constructed. On the basis of the genomic DNA library, this will aid in shedding light on the DNA difference between A and B chromosomes as well as the nature and origin of B chromosomes. In addition, it would be possible that B chromosomes are modified as vectors of target genes in genetic engineering, resulting in the creativity in plant genetic improvement.

B染色体是存在于许多生物体细胞内不同于正常染色体的小染色体，由于目前尚缺乏对其遗传机制和本质属性的认识，它仍是染色体遗传中的一个不解之迷。本研究立足于已有的研究基础，采用常规染色体制片技术，在玉米地方品种群体中细胞学鉴定、识别和定位B染色体；通过显微分离技术分离B染色体；分别用接头介导PCR(LA-PCR)和简并引物PCR（DOP-PCR）技术，体外扩增B染色体DNA；扩增产物（DNA片段）经分离、纯化及Southern杂交分析后，与质粒载体连接，再转化大肠杆菌细胞，在转化产物中挑取阳性克隆进行阳性鉴定和琼脂糖凝胶电泳检测；筛选出的阳性克隆用于构建玉米B染色体DNA文库。构建B染色体DNA文库可为全面剖析常染色体与B染色体的DNA序列差异、认识B染色体DNA本质和探讨B染色体的起源进化奠定物质基础，并有利于开发B染色体在基因工程中作为目标基因载体的潜能，进而创新植物遗传改良方法。

B染色体是存在于生物细胞内超过正常染色体数目的附加染色体。B染色体可同时传递和稳定表达多个基因，具有作为基因工程载体的潜能，而开发B染色体载体潜能的主要障碍在于人们缺乏对其遗传本质的认知。为此，本研究以玉米地方品种和自交系为材料，采用常规染色体制片技术鉴定根尖细胞B染色体，显微切割分离B染色体，体外扩增B染色体DNA序列，以扩增产物构建玉米B染色体DNA文库。细胞学鉴定结果表明，玉米B染色体呈现形态和数量多态性，在供试材料中检测到三类形态的B染色体：中间着丝点B染色体—BM、近端着丝点B染色体—BST和呈点状的微小B染色体—BS，BM形态上与玉米的第1号常染色体相似，BST与BM大小相近，BS呈圆点状，无可见着丝点；就B染色体数目而言，具有0B、1B、2B和3B染色体的细胞数目分别占检测细胞总数的95.63%、3.33%、0.67%和0.40%，玉米自交系B染色体频率较地方品种低。在项目研究中，通过创新染色体制片技术，采用滴片技术创制了适宜玉米B染色体分离的制片方法，即笑气处理时间2 h、最佳冰乙酸固定时间2 h、最佳酶解时间6 h和滴片距离35 cm。以含有B染色体的制片为载体，采用毛细管玻璃针显微切割和激光显微切割分离技术分离获取B染色体192条。分别用接头介导PCR(LA-PCR)和简并引物PCR（DOP-PCR）技术，体外扩增B染色体DNA。扩增产物（DNA片段）经分离、纯化、荧光原位分析及部分DNA片段测序后，与质粒载体连接，再转化大肠杆菌细胞，成功构建了两个玉米B染色体DNA文库。玉米B染色体DNA文库的构建不仅为认知B染色体的遗传本质和探讨B染色体的起源进化奠定了物质基础，也有助于开发B染色体在基因工程中作为目标基因载体的潜能。依托本项目，在“Biochemical Systematics and Ecology”、“International Journal of Agriculture and Biology”、“作物学报”和“中国农业科学”等刊物发表相关学术论文12篇，其中SCI论文2篇，申请相关专利4项，较好地完成了项目所列任务指标。