以群体遗传学研究手段探讨云杉乳菇复合群内的种系分化和杂交事件

The Lactarius deterrimus complex consists of seven closely related wild edible mushrooms that form host specificity with spruces. Former studies found a large number of ITS heterozygotes and samples with ambiguous identities. On top of this, the co-occurrence of host specificity and occasional host shifts and co-occurrence of endemism and Eurasia distribution suggest it to be an ideal case for investigating speciation and hybridization of ectomycorrhizal fungi. This project is to conduct the following studies: collecting representative populational samples from domestic sites and abroad, screening and amplifying the Simple Sequence Repeats (SSR) and Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) markers based on genome data obtained by Reduced-Representation Genome Sequencing, and using them to analyze the genetic diversity and genetic structure regarding populations and species. This study aims to answer the following questions: 1. Are the currently recognized species, as defined by ITS typing and subtle morphological differentiation, distinct genetic entities? 2. Are there real interspecific hybridization? 3. Is genetic diversification related with symbiotic relationships and geographical distribution? Studies on these issues will help to understand the microevolution of ectomycorrhizal and provide solid genetic data for conservation and DNA markers for screening isolates for artificial cultivation of these economically important fungi.

云杉乳菇复合群（Lactarius deterrimus complex）包含了7个与云杉共生的、极为近缘的食用菌物种。前期研究发现了大量的ITS杂合子样品和“多重身份”样品。高度的宿主专一性和偶然的共生树种跳转现象共存、物种的特有分布和洲际广布现象并存，使这一类群成为研究外生菌根菌种系分化和杂交事件的理想类群。本项目拟在国内外采集6个种的代表居群样品，通过简化基因组测序技术，在基因组水平上筛选、扩增二种分子标记：简单重复序列（SSR）和单核苷酸多态性片段（SNPs），通过计算居群水平和物种水平上的遗传分化和遗传结构回答以下问题：1. 现知物种是否已分化为不同的遗传实体？2. 是否存在种间杂交事件？3. 种群的遗传分化是否与共生关系和地理分布有关？对以上问题进行研究，有助于了解外生菌根菌的微进化过程，并为该类真菌的资源保护和菌株筛选提供可靠的遗传数据。

2018-2020年于横断山区的云川藏地区进行了7次野外考察，采集到57个居群的557份样品。完成了568份标本的DNA提取，对其ITS片段进行了扩增。对拷贝间存在插入缺失（INDEL）的245条序列进行了分型，获得811条单倍型ITS序列，确定了7个物种的纯合基因型和5种杂交组合，其中1种基因型为本研究的新发现。.基于Lactarius pseudohatsudake的基因组序列设计出30对引物。根据扩增成功率、位点分型的难易、位点是否具有多态性对这30对引物进行了评估，最终确定了10对引物扩增10个SSR位点。由于SSR多态位点之外还存在多个INDEL，将实验方案进行了调整，舍弃毛细管电泳采用桑格测序分析的SSR多态性和SNPs。对477份代表样品进行了扩增并进行群体遗传学分析。有以下新发现：1. 前期基于ITS序列和微妙的形态差异识别出的物种不是明确分化的遗传实体。在每一个SSR位点上，每个物种几乎都不拥有私有等位基因。ITS上发现的大量杂合子不是种间杂交个体，也不是进化上的盲端，而是在地理种群内自由的基因交流中产生的杂合个体。2. 项目执行前和执行中共发现200个无法确定其身份的样品，研究表明，这些样品与那些形态相近的物种间存在频繁的基因交流。这些样品并不代表独立的进化谱系，而是不完全谱系分选的产物。3.项目执行中首次发现云杉乳菇复合群的物种可以与云南铁杉共生，这些样品与生于云杉林下的样品间不存在基因交流障碍。共生树种的跳转在并不需要特殊的遗传背景。4. 项目研究了18份采自美国、德国、芬兰、瑞典的标本，发现在云杉乳菇和北欧乳菇中，欧亚间断分布的物种并未在各洲形成各自有代表性的种群，但横断山区与环北极地区的种群来源可能不同。.项目执行期间，分离云杉乳菇复合群菌株65株，培养后成功保存的活体菌株40株。采用4种培养基和4种激素进行了菌丝培养实验。研究发现，菌丝在加入云杉乳菇子实体浸出液的PDA培养基上生长最快，不同菌株间生长速度有显著差异。.项目研究中还发现了一种专性与国家二级保护植物华南五针松共生的近缘物种广东乳菇Lactarius guangdongensis（新种）。该发现对于华南五针松的种源保护和菌根育苗具有重要意义。