间隙连接介导的甘草次酸调控肾脏TXNIP-Trx氧化还原体的机理研究

Gap junction (GJ) plays a pivotal role on renal physiological and pathophysiological process. GJ can regulate oxidative stress and protect renal against oxidative injury. However the detailed mechanisms and roles in kidney are still unclear. Among the 21 connexins, connexin 43 (Cx43) is one of the most widely expressed and intensively studied connexins. Thioredoxin interacting protein (TXNIP) and thioredoxin (Trx) are important redox regulators and have been called redoxisome since they are attracting growing attentions in a variety of biologic process. Given that glycyrrhetinic acid(GA), the main extract from glycyrrhizae herb, is one of the usually used gap junction blockers and can decrease connexins and suppress GJ-mediated communication. What is the relationship between GJ and TXNIP-Trx redoxisome? In this study we will investigate whether and how GJ regulate TXNIP-Trx redoxisome in kidney..Normal rat kidney tubular cell lines and murine podocytes oxidative injury model in vitro and Cx43 transgenic mice model in vivo are involved in this study to elucidate the mechanisms underling the regulation of GA on TXNIP-Trx redoxisome mediated by GJ. These effects may be multiple, involving the regulation on protein, function and activity of TXNIP-Trx redoxisome. Furthermore, patients with different stage of chronic kidney disease are enrolled in this investigation. The urinary and serum Trx protein level, reduced form and oxidized form of Trx will be analyzed to clarify the role of Trx in chronic kidney disease. .In general, our study will complete the traditional Chinese medicine theory that glycyrrhizae protects kidney from toxicity by block the diffusion of pathogenic factors. Moreover, our research will provide the novel therapeutic target and strategy in the treatment of kidney disease.

间隙连接在肾脏的病理生理过程中具有重要作用，其可以调节氧化应激减轻肾脏氧化损伤，但机理并未完全明确。硫氧还蛋白结合蛋白（TXNIP）-硫氧还蛋白（Trx）是重要的氧化还原调控蛋白，被称为氧化还原体，参与了肾脏病的发生发展。甘草次酸是甘草的主要单体之一，是常用的间隙连接抑制剂，可抑制间隙连接蛋白及信号通讯。本研究将通过体外肾脏细胞、体内转基因小鼠细胞氧化损伤模型明确甘草次酸通过调节间隙连接调控TXNIP-Trx氧化还原体的机理，阐明间隙连接对氧化还原体蛋白、功能、活性的调节机制，并通过检测慢性肾脏病不同肾功能患者血、尿Trx水平及氧化还原状态，明确其在慢性肾脏病中的意义。本研究将进一步完善甘草解毒“阻邪入里”的中医理论，并为肾脏病的治疗提供新的治疗靶点和药物。

硫氧还蛋白（Thioredoxin，Trx）是体内重要的巯基还原系统，参与了氧化还原、细胞增殖等多个重要生物学过程。硫氧还蛋白结合蛋白（TXNIP）是Trx的内源性抑制剂，在调节糖脂代谢和氧化还原方面也发挥着重要作用，两者相互调节，构成TXNIP-Trx氧化还原体。我们前期研究发现间隙连接（Gap junction，Gj）能够调节氧化应激，减轻肾脏损伤，本项目通过体内外研究探索了甘草次酸（Ga）抑制GJ调控TXNIP-Trx氧化还原体（Redoxisome）的作用和机制。. 我们发现在肾小管细胞系NRK-52e中，Ga抑制Gj后，通过ERK1/2介导，提高了TXNIP的磷酸化和泛素化，促进了蛋白酶体依赖的TXNIP蛋白的降解。我们利用Trx抑制剂PX-12，抑制Trx后诱导了氧化应激、激活JNK、诱导Cx43蛋白上调，造成细胞损伤。Ga抑制Cx43可以减轻PX-12对Trx的抑制，发挥抗氧化抑制JNK减轻细胞损伤的作用。ROS-JNK-Cx43-Trx相互调节，维持Trx水平。因此，Ga通过抑制间隙连接，下调Txnip、维持Trx活性，发挥调节Trx/Txnip氧化还原体的作用。.我们进一步研究了Trx活性的调节。Trx上巯基（HS-）与二硫键（-S-S-）的转化调节了其活性，维持其巯基的还原性能够提高其活性。PX-12通过与其巯基结合，影响其功能和蛋白水平，内源性硫化氢（H2S）可以维持Trx上HS-的还原性，但H2S合成酶主要在肿瘤细胞表达，肾小管细胞表达少。使用内源性H2S供给剂NaHS可以减轻Px-12诱导的细胞损伤，而抑制CSE活性可以增强细胞对PX-12毒性的敏感性。NaHS减轻了PX-12对Trx的抑制，可以促进Trx从氧化型向还原型转化，提高了Trx的活性。我们发现H2S可以与多种蛋白的巯基结合，影响多个生物学过程。Ga可能通过调节HS-活性，发挥多种作用。.临床研究发现，Trx主要分布在肾小管，而Txnip和Cx43蛋白在肾小球和肾小管均有丰富表达，不同肾脏病中Cx43、Txnip、Trx蛋白的表达是否存在差异，仍需深入研究。动物研究进一步证实了抑制Cx43蛋白可以减轻肾脏损伤。.本项目阐明了间隙连接调节Trx/TXNIP氧化还原体减轻肾脏损伤的机制，为甘草有效成分治疗肾脏病提供了依据，完善了甘草解毒中医理论的物质基础。