IFRG15在植入前早期胚胎发育中的功能及机制

The critical problem of preimplantation embryonic development is the cell proliferation and cel differentiation, and the transcript factor play an important role in the regulation of cell proliferation. The incorrect expression of critical transcript factor can affect the cell proliferation and induce the retardation in the preimplantation embryonic development. IFRG15 was the gene which we screened in the previous work and found that it was related with embryonic development.This gene was upregulated in the 8-cell embryos and it was significantly lower expressed in the retardated 8-cell embryos than that in the normal embryos.These results indicated that IFRG15 might play an important role in the process of embryonic development. Our preliminary study showed that IFRG15 might play its role by regulating JAK/STAT signal pathway. Since until now there is no a report about the function and mechanism of IFRG15 in the process of embryonic development,we want to study its functional role and potential molecular mechanism in the process of embryonic development through the RNAi and overexpression experiments. These results can provide the theoretical basis for helping to clarify the regulation mechanisms of embryonic development and provide potential targets for increasing the ratios of blastaea with high quality in clinical.

植入前胚胎发育的核心问题是细胞增殖和细胞分化，而转录因子对细胞增殖的调控发挥重要作用，关键转录因子表达异常会影响细胞增殖, 从而导致植入前胚胎发育阻滞。IFRG15是我们前期筛选发现的、与植入前胚胎发育相关的转录因子。该基因3.0倍差异高表达于8细胞阶段的小鼠胚胎中，且IFRG15在8细胞期发育阻滞的小鼠胚胎中的表达显著低于发育正常的早期胚胎，提示IFRG15在植入前胚胎发育过程中可能发挥重要作用。初步研究发现，IFRG15可能通过与调节发育的JAK/STAT信号通路密切相关。鉴于目前对IFRG15在植入前胚胎发育过程中的功能与机制研究尚属空白，我们期望能通过RNAi和过表达等实验，研究IFRG15 在植入前胚胎发育过程中的作用及可能的分子机制，为进一步阐明植入前胚胎发育调控机制提供理论依据，为临床提高优质囊胚率提供候选基因。

IFRG15是本实验室前期从小鼠的MⅡ期卵母细胞蛋白表达谱中鉴定得到的一个特异性高表达蛋白质，其确切功能未知且在卵母细胞及植入前胚胎中鲜有研究。我们进行了如下实验深入了解IFRG15蛋白的生物学功能及作用机制。.首先， Ifrg15 mRNA在生殖系统中高表达；在生发泡期卵母细胞、停滞于第二次减数分裂中期卵母细胞和受精卵中均有表达，2-细胞阶段其表达量显著升高且在植入前胚胎中维持较高水平。由此提示：IFRG15蛋白可能作为一种母源因在植入前胚胎发育过程中发挥重要作用。其次，利用显微注射小干扰RNA片段技术，特异性沉默Ifrg15在小鼠植入前胚胎中的表达。结果发现胚胎发育明显受阻于1-细胞阶段，并且发育受阻的程度与siRNA浓度呈明显的剂量依赖关系。同时将特异性siRNA注射入2-细胞阶段胚胎中的单个卵裂球中，注射组胚胎发育为3-细胞。由此推测：IFRG15蛋白并不是特异性阻断第一次卵裂过程，而是抑制了植入前早期胚胎发育过程中的细胞周期进程。再次，联合利用活细胞工作站及显微注射技术实时观察发现：IFRG15特异性沉默后受精卵雌雄原核能够正常靠近到达受精卵中央，但融合异常。EdU掺入实验结果显示：阻断IFRG15蛋白的表达并不影响DNA的复制，受精卵阻滞于S期晚期或G2期。随后检测DNA双链断裂特异性标志物γH2AX及DNA损伤检测点活化的特异性标志物ATM的表达情况，提示：Ifrg15干涉组受精卵中γH2AX、ATM的表达量明显高于正常组及对照组。此外，对ZGA起始的特异性标志物的检测发现：Ifrg15特异性沉默的受精卵中MuERV-L、EIF-1a、HSP70.1及U2AFBP的表达量显著低于正常组。由此可见，特异性沉默IFRG15蛋白的表达可以导致DNA损伤，从而激活细胞周期中G2期DNA损伤检测点，并引起合子转录本激活失败，由此引发了细胞周期阻滞。最后，本研究进一步进行了受精卵沉默Ifrg15后转录组高通量测序的研究，结果显示：Ifrg15干涉组与对照组相比共鉴定出1445个差异基因，其中上调基因1086个，而下调基因359个。其中有相当部分的基因参与细胞周期、生殖等过程中，提示这些基因可能由IFRG15所介导，进而影响植入前胚胎发育过程。.综上所述，本研究首次证实了IFRG15蛋白在小鼠植入前胚胎发育过程的细胞周期中发挥至关重要的作用，并初步探索相关机制。