线粒体动态失衡介导的纳米银细胞毒性和亚硒酸钠的解毒作用

Sliver nanoparticle (AgNP) has been broadly used in medical and technological fields. Its mechanism of causing cell death are poorly defined and there is no preventive measure to reduce its cellular toxicity. Our preliminary study demonstrates that AgNP increases ROS production, decreases mitochondrial membrane potential, activates caspase-3 and causes cell death. Treatment with sodium selenite preventes the forementioned alterations induce by AgNP. We hypothesized that AgNP induce cell death through targeting the mitochondria by causing mitochondria dynamic imbalance and increasing autophagy, which subsequently opens MPTP and activates cell death pathways. The objectives of this study are: ①Define the role of mitochondrial dynamics(fusion and fission) and autophagy in AgNP induced cellular toxicity, using immunocytochemistry, Westen blot, mitochondrial morphological analysis, and electron microscopy;②Identify the soures of ROS production in AgNP treated cells;③Determine through which upstream pathways(mitochondria-initiated or receptor-mediated pathways) AgNP activates caspase-3; ④Empoly sodium selenite as an therapeutic approach to study the protective effects of selenium, especially to use PCR array to define if selenium reduces AgNP toxicity through activation of cell survival pathways；⑤ Further confirm whether the in vitro findings could be translated to in vivo using AgNP inhalation rat model. Successful completion of the proposed study will delineate the role of mitochondria in AgNP induced cell toxicity and selenite mediated protection.

纳米银（AgNP）广泛用于医疗和技术领域。它对环境卫生和人类健康的影响日益受到重视。前期实验证实AgNP增加ROS，降低线粒体膜电位，激活caspase-3，导致细胞死亡。我们依此提出AgNP损伤线粒体假说：AgNP通过增加ROS及干扰线粒体动态平衡导致线粒体裂解和自噬，引起细胞死亡。研究目的①组化染色、蛋白印迹、线粒体影像分析及电镜确定线粒体动态平衡和自噬在AgNP细胞毒性中的作用；②ROS标记与线粒体或NOX双染确定AgNP增加ROS生成部位；③Caspase-8和-9活性测定明确AgNP激活caspase-3的上游分子通路；④硒（Se）干预，PCR Array测定细胞存活相关分子判断Se的保护机制。SelH过表达或敲低研究Se是否通过调节SelH发挥作用；⑤动物AgNP吸入模型进一步验证AgNP在体毒性和Se的保护作用。研究结果将加深对AgNP细胞损伤的机制了解并找出预防方法。

纳米银（AgNP）由于其强力的杀菌作用被广泛用于医药、医疗器械、药理学、生物技术、工程、能源、磁场等领域。在AgNP大量生产、加工、使用以及最终处置的过程中会不可避免地释放到环境中，其对环境卫生和人类健康的影响日益受到重视。而AgNP导致细胞死亡的机制尚不明确，目前主要包括DNA损伤、线粒体毒性、活性氧(ROS)积累、ROS依赖和独立的细胞信号通路的激活以及炎症反应等。AgNP可与线粒体相互作用提示线粒体可能是AgNP毒性的细胞内靶点。既往研究显示AgNP诱导的线粒体毒性主要有氧化应激、线粒体去极化和抑制线粒体电子传递链关键酶，目前尚无研究观察AgNP 对线粒体超微结构、功能及线粒体动态平衡的影响。同时寻找AgNP细胞毒性的预防措施具有重要意义。微量元素硒因其重金属解毒作用而闻名，硒能恢复抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的活性，能够促进线粒体再生和增强线粒体呼吸功能，抑制线粒体分裂和自噬。目前尚无研究阐明硒对纳米银的解毒作用及其对线粒体的保护作用机制。本研究通过检测血清丙二醛（MDA）、还原性谷胱甘肽的水平（GSH），使用组织病理染色、蛋白印迹、电镜观察线粒体超微结构、线粒体功能检测（ROS、TMRM、ATP NAD/NADH）等多种方法确定AgNP的细胞毒性和线粒体毒性，阐明了AgNP导致线粒体动态失衡和自噬在其细胞毒性中的作用，明确了AgNP激活caspase-3的上游分子通路，及亚硒酸钠的保护作用机制。通过体外动物模型，我们进一步证实了AgNP的在体毒性及其毒性机制可能与线粒体动态失衡有关，在体外水平阐明了Se的保护作用及机制。本课题从在体和细胞水平上探讨了线粒体动态失衡介导的AgNP细胞毒性及Se的解毒作用，研究结果进一步加深了线粒体动态失衡在AgNP细胞毒性中的作用并明确了亚硒酸钠的解毒作用，为AgNP细胞毒性的防治提供理论依据。