截型苜蓿MtCBF4提高植物耐冷性和促进结瘤的分子机制研究

Our previous studies showed that Medicago truncatula MtCBF4 positively controlled the cold tolerance and nodulation. The MtCAS15 was the target gene of MtCBF4 by EMSA and ChIP. On these basis, this project intends to study the molecular mechanism on MtCBF4 improves cold tolerance and promotes nodulation. The main research contains three aspects. Two yeast single hybrid cDNA libraries will be screened to look for the MtCBF4 upstream transcription factor. High throughput ChIP - Seq will be used to search MtCBF4 downstream target genes. Furthermore, EMSA, ChIP, plant transcient and stable transformation system, quantitative PCR will be used to confirm the gene function in vitro and in vivo. Integrated above research results, we expect to uncover the MtCBF4's molecular regulation pathway on cold tolerance and nodulation respectively. The crosstalk between the two pathways will be discussed combining with MtCBF4 and upstream key genes in response to plant hormones.These results will provide important value for leguminous plant quality breeding.

本实验室前期研究结果表明，MtCBF4正向调节截型苜蓿耐冷和结瘤固氮两个生物学过程，并通过EMSA和ChIP确定了MtCAS15是MtCBF4的一个直接正调控靶基因。在此基础上，本课题拟挖掘MtCBF4的上、下游基因，深入研究其提高植物耐冷性和促进结瘤的分子机制。主要研究内容包括：通过分别筛选截型苜蓿冷胁迫和根瘤两个酵母单杂交cDNA文库，寻找MtCBF4上游转录因子；通过ChIP-Seq技术高通量筛选MtCBF4下游靶基因。进一步通过EMSA、ChIP、截型苜蓿瞬时转化系统、截型苜蓿稳定转化系统、荧光定量PCR等体外、体内实验确证MtCBF4上、下游关键基因的功能。综合以上研究结果，解析MtCBF4提高植物耐冷性和促进结瘤的分子调控路径，并结合MtCBF4及其两条通路的上游关键基因对乙烯、细胞分裂素等激素的响应，探讨这两条路径的交叉点。本课题的研究结果对豆科植物抗逆优质育种具有重要价值。

本项目结合高通量技术RNA-seq、筛选酵母双杂文库、酵母单杂文库和EMSA、ChIP等实验验证，获得了调控MtCBF4的上游转录因子MtMYB3和MtMYB61，明确了MtCBF4下游靶基因MTCAS15，提出了MtCBF4参与冷驯化的工作模型。在室温情况下，MtMYB3抑制MtCBF4基因的表达，当植物感受低温之后,上调表达的MtMYB61与MtMYB3互作解除了MtMYB3对MtCBF4的转录抑制，表达积累的MtCBF4直接激活MtCAS15并上调其他冷胁迫相关基因的表达，提高植物对冷胁迫的耐受能力。相关研究成果发表在Plant Physiology（2016）。本研究成果首次阐明了一条由两个MYB类转录因子通过互作精细调控CBF基因表达的信号通路，为豆科植物的抗冷育种提供了理论基础。.本项目还筛选出了冷胁迫下调控MtCBF4的另一个转录因子MtNAC3，在截形苜蓿中过表达黄花苜蓿MfNAC3在冷驯化和非冷驯化条件下都可以显著提高截型苜蓿对冷的耐受能力，相关研究成果发表在Environmental and Experimental Botany（2016），本实验结果具有重要应用价值。.本项目还筛选出结瘤固氮通路中MtCBF4的上游转录因子MtWRKY76，过表达MtWRKY76转基因植株结瘤数目显著提高，wrky76-TALEN敲除株系结瘤数目显著下降，并且MtWRKY76正调控结瘤相关基因NSP1、NSP2、NIN以及EFD的表达，研究结果表明MtWRKY76和MtCBF4参与结瘤固氮的自调节途径。相关研究结果发表在Environmental and Experimental Botany（2016）。分别过表达MtCBF4和MtWRKY76都能够提高苜蓿的抗逆性和促进结瘤，说明MtCBF4和MtWRKY76都是多功能转录因子，具有重要的育种价值。