PLIN2基因调控乌金猪肌内脂肪细胞脂类代谢的分子机制

The biological functions of candidate genes and their regulating mechanisms for intramuscular fat are important scientific questions to study using Chinese indigenous pig species. However, the functions and regulating mechanisms of candidate genes for intramuscular fat lack deep evaluation at present. In our previous study, we found that PLIN2 gene were significantly associated to triglycerols content in intramuscular adipocytes isolated from muscle tissues of Wujin pigs. This project will continue to use intramuscular preadipocytes and focus on lipid metabolism and investigate the following aspects. First, we will detect the expression levels of the PLIN2 gene and lipid metabolism genes using over-expression technology to find the possible target genes of the PLIN2 gene. Second, the exprssion levels of the PLIN2 gene will be down-regulated by RNAi. At the same time, the expression levels of target genes and lipid metabolism genes will be determined. Third, the mutual interactions of PLIN2 and its target genes will be measured using yeast two-hybrids systems, aiming to confirm that the PLIN2 gene regulate the lipid metabolism via its target genes. The objective of this project is to clarify the role of PLIN2 gene in porcine IMF deposition. The results of this project will provide the theoretical guidance and the scientific basis for PLIN2 gene as a marker-gene in molecular breeding to promote porcine intramuscular fat deposition to improve the meat quality.

中国地方猪种肌内脂肪沉积侯选基因的功能及调控机制是肌内脂肪沉积研究的重要科学问题，目前对肌内脂肪沉积候选基因的功能及其调控肌内脂肪沉积的机制仍缺少深入的认识。本项目继续以乌金猪肌内脂肪细胞为材料，以课题组前期研究发现的参与乌金猪肌内脂肪细胞脂类代谢途径的PLIN2基因为研究对象，围绕脂类代谢，利用基因过表达技术检测PLIN2基因过表达引起的肌内脂肪细胞脂类代谢基因表达的改变，确定可能的作用靶基因。利用RNAi技术下调PLIN2基因的表达，检测靶基因表达水平的改变及脂类代谢基因表达的变化。利用酵母双杂交技术检测PLIN2基因的表达产物与靶基因的表达产物之间的相互作用，证明PLIN2基因是通过作用于靶基因而调控了肌内脂肪细胞脂类代谢，从而明确PLIN2基因的功能及调控肌内脂肪沉积的机制。该项目的研究结果将为PLIN2作为标记基因，辅助育种，提高肌内脂肪含量，改善肉品质，提供理论指导和科学依据。

PLIN2属于PAT蛋白家族成员，位于脂滴表面，促进脂肪沉积，可作为猪肌内脂肪沉积的候选基因。本项目围绕PLIN2基因的表达、克隆及功能验证进行了研究，结果显示：（1）乌金猪在脂肪组织中的表达量最高，乌金猪饲喂WJ日粮肌肉组织PLIN2基因mRNA表达量均高于NRC日粮（P<0.05），乌金猪肌肉组织PLIN2基因mRNA的表达量，60kg屠宰体重mRNA表达量最高（P<0.05），乌金猪肌肉组织PLIN2基因mRNA表达量高于长白猪，且达到显著水平（P<0.05）。克隆PLIN2基因，获得CDS全长为1380bp，编码459个氨基酸。（2）成功构建PDS087_pL6-TO-V5-GIM-PLIN2慢病毒载体和LV297-pl-Sh6-PLIN2干扰载体。病毒载体转染实验24小时后，在荧光显微镜下同一视野的荧光和可见光照片显示细胞生长良好，流式细胞仪检测L6-PLIN2慢病毒滴度为1.48 E8 TU/ml。QPCR验证结果表明过表达慢病毒可明显提高目的基因的表达。 LV297_pL-Sh6-PLIN2病毒可有效干扰靶细胞目的基因PLIN2表达，干扰效果达70%以上。甘油三酯的含量随分化时间增加而增加。第3天后增加趋势更明显。同一时间点，与对照组相比，plin2过表达组的甘油三酯含量较高（P<0.05），plin2干扰组的甘油三酯含量较低（P<0.05）。脂肪细胞随分化时间增加，脂肪细胞逐渐增加；其中第5-10天，脂肪细胞增加明显。过表达plin2基因可增加脂肪细胞分化程度。干扰plin2基因可明显降低脂肪细胞分化程度。PLIN2、C/EBPα、PPARγ、ACC、FAS、SREBP-1c 、H-FABP、A-FABP 、DGAT-1、LPL、HSL、ATGL、Leptin、AdipoQ的相对表达量变化均随诱导分化时间增加而增加（P<0.05）。其中D0到D3增加趋势缓慢，D3到D10增加趋势较快。同一时间点，与对照组相比，PLIN2过表达组目的基因的表达量均较高（P<0.05），PLIN2干扰组目的基因的表达量均较低（P<0.05）。本项明确 PLIN2 基因的功能及调控肌内脂肪沉积的机制，为PLIN2基因作为候选基因应用于脂肪代谢调控奠定了基础。