三甲胺和氧化三甲胺在深海细菌Myroides profundi D25适应高盐、高压环境中的作用与机制

Trimethylamine (TMA) and Trimetlylamine N-oxide (TMAO) are abundant and widespread in the ocean. Usually, it is considered that TMAO and TMA are utilized by marine bacteria as carbon and nitrogen resources. In the utilization pathway, TMA monooxygenase (Tmm) that can covert TMA to TMAO and TMAO demethylase that can convert TMAO to dimethylamine played an important role in the utilization of TMAO and TMA by marine bacteria. Our previous study showed that the genome of bacterium Myroides profundi D25, belonging to the family Flavobacteriaceae of the phylum Bacteroidetes and isolated from the deep-sea sediments of the southern Okinawa Trough, encodes a Tmm gene that was upregulated greatly in the high salinity condition. Addition of TMA in the medium can facilitate the growth of M. profundi D25 in the high salinity and high pressure conditions. However, the genome of M. profundi D25 does not encode the enzymes responsible for TMA synthesis and Tdm responsible for TMAO degradation. Based on these experimental results, we proposed out basic scientific hypothesis: strain M. profundi D25 adsorb TMA from extracellular environment into the cell, then the TMA was converted to TMAO by Tmm and TMAO may benefit the growth of strain facing high salinity and high pressure conditions. In order to test this hypothesis, this project tends to study: firstly, find and identify the transporter that responsible for transferring the TMA into the cell; secondly, verify the function of Tmm in M. profundi D25 and then study its biochemical characteristics; thirdly, detailedly study the physiological functions of TMAO in the strain M. profundi D25 when facing high salinity and high pressure conditions and further study the universality of the physiological functions of TMAO in deep-sea bacteria. The study of this project may find and identify new physiological functions of TMA and TMAO for the survival of deep-sea microorganisms.

三甲胺（TMA）及氧化三甲胺（TMAO）在海洋中分布广泛且总量巨大。通常认为它们主要是作为碳、氮源被海洋微生物所吸收利用，其中氧化TMA生成TMAO的TMA单加氧酶（Tmm）和起始TMAO降解的TMAO脱甲基酶（Tdm）起着重要作用。本项目前期研究发现深海细菌Myroides profundi D25（D25）中Tmm基因在高盐下表达量明显升高，外源添加TMA有利于菌株耐盐、耐压。D25基因组中无Tdm基因及合成TMA的基因。据此提出如下科学假设：D25从环境中转运TMA进入胞内，在胞内通过Tmm氧化TMA生成TMAO，从而发挥耐盐、耐压的生理功能。为验证该科学假说，本项目拟：① 发现和鉴定菌株中TMA的转运载体；②验证Tmm的功能并分析其生化特性；③通过生理与遗传学证据，验证TMAO在菌株耐盐、耐压中的作用，并分析这种作用的普遍性。本项目有望发现TMAO在深海细菌极端环境适应中的新功能。

深海是地球上最大的生态系统，其中生存有大量微生物。高压是深海环境的一个显著特点，会对微生物造成非常大的损伤。为了在高压环境下生存，深海微生物进化出一系列适应策略。然而，在深海微生物基因组中还没有发现与深海适应有关的标志性基因。三甲胺（TMA）和氧化三甲胺（TMAO）是海洋中重要的含氮有机分子，在海洋中广泛分布。菌株Myroides profundi D25属于拟杆菌门，是一株分离于深海的菌株。D25菌株可以在4°C、12 MPa环境下生长，说明此菌株可以适应深海低温、高压环境。本项目以D25菌株为研究对象，阐明了三甲胺和氧化三甲胺在D25适应高盐、高压，特别是高压环境中的作用与机制。研究发现D25菌株科研通过吸收培养基中添加的TMA在胞内积累TMAO，从而提高其对高压的耐受能力。对D25菌株中TMA转运蛋白TmaT进行了鉴定与性质表征，发现TmaT蛋白在低温下可以较好地转运底物TMA，与D25菌株所处的深海低温环境相适应。对D25菌株中负责催化TMA氧化生成TMAO的三甲胺单加氧酶进行了鉴定与性质表征，发现该酶表现出适应深海低温、高压的特征。D25菌株从而可以在深海原位环境下利用其三甲胺单加氧酶氧化TMA积累TMAO，从而行使耐压的功能。由于D25菌株难以进行遗传操作，用大肠杆菌菌株验证了TmaT蛋白和三甲胺单加氧酶在细胞内的生理功能。结果表明，在大肠杆菌中同时表达TmaT蛋白和三甲胺单加氧酶使菌株能吸收TMA并在胞内积累TMAO，并使菌株具有了一定的耐压特性。进一步验证了这两个蛋白耐压相关的生理功能。通过生物信息学分析发现TmaT和三甲胺单加氧酶同源蛋白在拟杆菌门菌株中分布广泛。与D25菌株中的研究结果相一致，在培养基中添加TMA后可以促进含有两种基因的菌株在高压环境下的生存和生长，表明D25菌株利用TMAO耐压的策略在其它海洋拟杆菌门细菌中也存在。TMA在深海海域含量丰富，因此由TmaT和MpTmm同源蛋白参与的TMA代谢为深海拟杆菌门菌株提供了一个简单而经济的适应高静水压的方式。本项目首次发现深海微生物三甲胺单加氧酶基因与耐压性相关以及氧化三甲胺新的生态功能，为深入了解海洋微生物适应深海高压环境机制开辟了新的研究方向。