巨桉锌指结构蛋白基因EgrZPCT在抗冷胁迫中功能和调控机制的研究

The planting area of Eucalyptus grandis tree will be expanded and the lost caused by low temperture also will be decreased, if we learned about the molecular mechanism of cold tolerance in it. According to our data of digital gene expression profiling (DGE) under the condition of different low temperature treatment to Ecucalyputs grandis seedlings, a gene which encodes zinc-finger protein was selected because its expression was induced strongly under low temperature. Result of our previous research showed that the protein sequence of it has a high similarity to AtZAT12, a gene playing an important role in a special pathway related with cold tolerance. And, the quantitative RT-PCR result showed the gene was only induced by low temperature, and other abiotic stresses has no influence on its expression. We predicted that the gene was involed in the cold tolerance of Eucalyptus grandis and named it EgrZPCT(zin-finger protein of cold tolerance).Its full length of cDNA sequence and promotor sequence has been cloned. To elucidate the function of EgrZPC, overexpression, RNA interference and promotor/GUS vectors will be constructed and tranformed to Eucalyptus. The transgene seedlings will be used to analyze the function of EgrZPCT with molecular and physiology experiments. The research on regulation mechanisms of EgrZPCT is also very important. In this study, Yeast one-hybrid experiment will be used to screen genes which regulate EgrZPCT expression from cDNA library constructed with tissures of Eucalyptus under low temperature. In the other hand, the core sequence of promotor binded by EgrZPCT will be found with CASTing technic, and genes which promotes has the sequence will be seached and analyzed with bioinformatic tools.

研究巨桉抗冻的分子机制，对扩大其栽培领域，降低低温造成的经济损失有重要意义。我们从巨桉不同低温处理的数字表达谱（DGE）数据中，得到一个受低温强烈诱导的编码锌指结构蛋白的基因EgrZPCT，并对其基因和启动子序列进行了克隆。前期研究表明，该基因受低温特异诱导，蛋白质与拟南芥ZAT12同源性较高，很可能是参与巨桉抗冷一条重要分子途径中的关键基因。本课题准备构建超表达、干涉和启动子指导GUS表达载体进行巨桉的遗传转化，通过对转基因植株在不同低温处理条件下的分子、生理分析，明确EgrZPCT的功能；另一方面，由于植物抗冷分子机制中，锌指蛋白类基因的调控机制至今不明确，我们准备运用酵母单杂交和CASTing技术，对调控EgrZPCT表达的上游基因和EgrZPCT所调控下游基因启动子上的结合序列，进行钓取和筛选，明确EgrZPCT在巨桉抗冷分子途径中的调控机制。

锌指结构蛋白转录因子基因EgrZFP1（原名为EgrZPCT），参与的巨桉低温胁迫响应过程，是一个新型抗冷分子途径。本课题通过酵母杂交，遗传转化，和CASTing技术，并结合高通量测序，生物信息学手段，研究EgrZFP1在巨桉低温胁迫中所发挥作用的具体分子机制。首先通过同源克隆，获得了同样受低温诱导的巨桉中其它6个锌指结构蛋白基因。分析了他们的基因结构和非生物逆境条件下的表达特征，并通过异源转化初步研究了EgrZFP1在低温胁迫中的功能。其次，我们构建了用于酵母的杂交全长cDNA文库，利用酵母单杂交、双杂交的手段，获得了调控EgrZFP1基因表达的3个上游候选基因EgrDREB2A，EgrCR和EgrNAC1，并对这些基因的功能进行了初步的研究；同时，还筛选出与EgrZFP蛋白互作的6个蛋白，其中包括与EgrZFP1互作的3个蛋白。EgrZFP1蛋白表达纯化后，开展的CASTing技术，确定了EgrZFP1调控下游基因时所结合的顺式作用元件序列为：CA/G/CA/GA/GA/GC/T。我们还对4℃不同处理时间（0.5，2，6，12，24和48h）的巨桉叶片进行了数字表达谱测序，在此基础上，对低温下与EgrZFP1共表达的基因进行了分析，为进一步分析EgrZFP1在低温下的调控机制提供了重要的信息。综合上述结果，本研究为EgrZFP1在巨桉抗寒中的功能和分子机制深入研究奠定了坚实的基础，并在分子水平上大大丰富了巨桉抗寒的信息。在项目的资助下，项目组共发表论文4篇，培养硕士研究生5名，其中3名取得硕士学位，2名在读。项目投入经费78万元，支出64.2967万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费13.7033万元，剩余经费将用于本项目研究的后续经费开支。