磷胁迫下东海原甲藻基于转录组测序的分子适应机制解析

Knowledge of molecular adaptation mechanism of harmful algae under the phosphorus limited condition is　significant to understand its　advantage over other marine phytoplankton, occurrence mechanism of red tide,　physiological response, and production of toxin. The current study will focus on　one of the most important red tide-forming species-Prorocentrum donghaiense in　China. To discover the molecular adaptation mechanism, P. donghaiense will be　cultured under phosphorus-repleted and phosphorus-limited condition, and then　used to extract　total RNA, construct sequencing library, perform high-throughput sequencing by　Illumina/Solexa, deeply identify differentially-expressed genes. Using phosphorus　metabolism, stress, and cell circle-related genes as main objects, the full-length cDNA will be cloned and then used to perform bioinformatics analysis. Finally,　both the time-effect of critical genes and physiological response under phosphorus-repleted and phosphorus-addition culture conditions will be investigated. The current　study will not only provide a full knowledge of molecular response of P. donghaiense under phosphorus-limited condition, deepen the understanding of molecular ecological adaptation mechanism of P. donghaiense, but also is significant for the unveiling of occurring and disappearing of P. donghaiense blooms. In addition, the　results obtained from this study will lay good foundation for the related study of other harmful dinoflagellate.

了解有害藻类对磷胁迫的分子适应机制，对于认识其较其它浮游植物具有更强生长优势、赤潮形成机制、生理应答及毒素产生均具有重要意义。本项目拟以我国重要赤潮原因种—东海原甲藻为研究对象，在磷胁迫和非胁迫条件下培养藻细胞，提取RNA，构建测序文库，应用llumina/Solexa 高通量转录组测序技术，深度发掘和鉴定差异表达基因；进一步以磷代谢、环境胁迫应答及细胞周期相关基因为重点研究对象，克隆 cDNA 全长，通过生物信息学分析其可能参与的生理活动；最后，还将考察在磷胁迫和补偿条件下关键基因表达的时间效应，同时对生理参数进行测定，并推测基因表达与生理应答的关系。本研究不但能系统认识东海原甲藻对磷胁迫的分子响应，还将有助于该藻分子生态学适应机制的了解，同时也将丰富东海原甲藻赤潮生消机制的研究内容。此外，本研究结果对其它有害甲藻的相关研究也有一定的借鉴意义。

东海原甲藻是我国东海最为重要的赤潮藻之一。了解东海原甲藻对磷胁迫的分子适应机制，对于认识其较其它浮游植物具有更强生长优势、 赤潮形成机制、生理应答及毒素产生均具有重要意义。项目主要研究容包括：（1）制备东海原甲藻无菌藻株，确定东海原甲藻最适磷培养浓度；（2）在磷胁迫和非胁迫条件下培养藻细胞，构建差异转录组测序文库，鉴定差异表达基因；（3）对差异表达基因进行生物信息学分析，解析东海原甲藻响应磷胁迫的分子应答机制；（4）采用RACE技术对关键基因进行全长cDNA克隆，考察在环境胁迫条件下关键基因的时间表达效应，测定生理参数，推测基因表达与生理应答的关系。主要结果包括：（1）确定东海原甲藻的最适磷培养浓度为36 μM；（2）东海原甲藻在磷胁迫条件下生长率下降，细胞体积增大，细胞总磷含量减少，而碱性磷酸酶活性升高；（3）响应东海原甲藻低磷胁迫的基因主要包括：细胞防卫和内稳态基因、磷代谢相关基因、细胞周期相关基因、光合作用、细胞蛋白质代谢相关基因、细胞骨架和结构蛋白、细胞代谢相关基因、DNA 代谢和修复相关基因、转录和翻译调控相关基因、参与信号通路基因和未分类或位置功能的基因等；（4）克隆获得东海原甲藻HSP90基因cDNA全长，HSP90的相对表达量在10 °C时最大，在低于20 °C下时，表达量随着温度升高而降低，在高于20 °C时，表达量随温度升高而升高，HSP90分别在氮浓度为88 µM、磷浓度为3.6 µM和铜离子浓度为31.25 µM时相对表达量最大；（5）获得东海原甲藻视紫红质基因全长cDNA，视紫红质蛋白在320 nm处有最大吸收峰，视紫红质基因表达量在持续光照循环中随光照时间延长先升后降，在持续黑暗循环中逐渐降低，在暗亮光照循环中呈现在黑暗条件下逐渐降低，恢复光照后表达量又急速上升，绿光照射可提高视紫红质基因表达量，低磷 (<7.2 µM)可诱导视紫红质的表达量。本项目研究结果为了解东海原甲藻在环境胁迫下的适应机制提供了新线索，对研究其他甲藻的适应机制也有一定的借鉴意义。