卵子极性维持与破坏对线粒体置换重构卵发育潜能的影响

As a newly born mitochondrial replacement technology, the first polar body transfer (PB1T) invented by our research group greatly promoted the clinical transformation of the technology for the reason it overcomes the bottleneck problem of previous mitochondrial replacement technology in intervention of maternal mitochondrial genetic disease. However, study found that abnormal fertilization rate of mitochondrial replacement egg and asymmetry of cleavage is higher than normal ICSI egg. The difference between PB1T and ICSI is that the former one needs enucleation operation which leads to destruction and reduction of oval polarity to a certain extent (this method called enucleation polarity destroy method, EPD). Based on these findings, our research group invented enucleation with polarity Reservation (EPR) method to reconstruct PB1T eggs. Then we compared the influence of EPR and EPD on the fertilization of EPR and EPD reconstructed oocytes, and their embryonic development, pregnancy, birth, development and recognition of the offspring. Not only the implementation of project further reveals the influence and effect of the polarity of mammal eggs in embryonic development (including natural embryos and artificial embryos), but also will instruct a totally new、efficient mitochondrial replacement assisted reproductive technology which lays a solid theoretical and technical foundation of clinical application transformation of mitochondrial replacement.

本课题组发明的第一极体移植（the first polar body transfer， PB1T）作为新诞生的线粒体置换技术，攻克了既往线粒体置换技术干预母源性线粒体遗传病瓶颈问题，推动了该技术临床转化步伐。然而，研究中发现 PB1T置换卵子异常受精率、卵裂不对称性高于常规ICSI卵子。PB1T与ICSI的不同之处在于前者需去核操作，导致卵子极性一定程度上的破坏与减少（称极性破坏去核法）。基于此，课题组发明了极性维持去核法构建PB1T线粒体置换重构卵子，对比极性破坏去核法制备的PB1T线粒体置换重构卵子，探索极性的破坏与维持对线粒体置换重构卵子受精、早胚发育、妊娠、产仔、子代发育、认知等的影响。项目的执行不仅进一步揭示哺乳动物卵子极性在胚胎发育（包括自然胚胎、各类人工重构胚胎）中的意义和作用，而且将建立一种全新高效的线粒体置换辅助生殖技术，为线粒体置换临床转化奠定坚实的理论和技术基础。

哺乳动物卵子在卵子发生过程中建立起来的极性是其减数分裂顺利发生的基础。重构胚与自然界正常受精胚最大的不同是前者需经历细胞松弛素B（CB）处理和损伤性去核显微操作，这些操作破坏了卵子漫长的成熟过程中逐步建立起来的卵子极性（因此被称为极性破坏去核法），因而可能导致重构胚的细胞全能性及其发育分化调控网络建立不完善。研究人员利用不同浓度CB处理卵子以破坏其极性，发现卵子极性破坏导致纺锤体结构异常和线粒体分布异常；通过下调标准CB浓度维持卵子极性，可保护线粒体超微结构和人卵母细胞纺锤体形态，提高线粒体置换有效性。在此基础上，研究人员针对经典的极性破坏去核法，以线粒体置换重构胚为研究对象，建立了一种极性维持去核法。研究人员还发现这种保留极性的去核方法诞生的重构卵或胚因为最大程度保留了卵子极性，可利用两次减数分裂清除核置换时带入的异源线粒体，降低了重构卵/胚中的线粒体异质性，因而该极性保留法未来有望提高线粒体捐赠技术的安全性和有效性，同时也提示卵子极性维持可能是母系遗传中线粒体净化的关键。在小鼠实验的基础上，研究人员建立了四种人线粒体捐赠技术并获得相应的线粒体置换胚胎干细胞，发现维持卵子极性可保障其重构胚早期正常发育，重构胚的胚胎干细胞表达人胚胎干细胞标志物，其基因表达、甲基化状态等与正常胚胎来源的胚胎干细胞无显著差异。这些重构胚胎干细胞与正常胚胎干细胞一样，具有分化成内中外三个胚层的能力。因此，维持卵子极性可保障人线粒体置换重构胚正常发育分化网格。研究结果表明卵子极性是影响哺乳动物重构胚细胞全能性建立及胚胎发育的关键要素，并建立了一种全新高效的重构卵／胚及线粒体置换辅助生殖技术，为改善全能重编程效率及促进线粒体置换临床转化奠定坚定的理论和技术基础。