季节性冻土地带土壤的冻结和冻融循环过程对大肠杆菌O157:H7的存活，迁移和毒力基因表达的影响及机制

In Chinese seasonal frozen zone, the untreated and inappropriately treated fecal wastes from livestock and poultry farms have resulted in serious soil microbial pollution by pathogenic bacteria. It is well accepted that, the physical, chemical and biological properties of soils may subject to significant changes during frozen and freeze-thaw processes. The changes in soil properties may in turn affect the reproduction, survival and transmission of pathogenic bacteria introduced into the soils, and ultimately the pathogens may enter into the food chain via different pathways, thus constitute a serious public health risk. Therefore, to study the environmental behavior of pathogens in seasonal frozen soils is an important research topic. In this project, we choose E. coli O157:H7 as targeted microbial pollutant, and investigate its survival and transport in soils from representative seansonal frozen zones under frozen and freeze-thaw conditions. We aim to identify key factors (e.g. assailable organic carbon and microbial community structure and composition) that influence the survival and transport of E. coli O157:H7 in soils under frozen and freeze-thaw conditions, reveal the molecular mechanisms (e.g. functional genes expression) related to E. coli O157:H7 transport in freeze-thaw treated soils, and understand the expression profiles of major virulence genes and quantify the end expression product Shiga toxins under freeze-thaw cycles conditions. The results from this project will be important to predict the environmental behavior of pathogenic bacteria in seasonal frozen zone soils, evaluate the environmental health risks associated with pathogens, and finally provide useful theoretic background information for the design of corresponding control strategies.

在我国季节性冻土地带，畜禽养殖产生的粪便及其不当处理造成了严重的病原菌污染。季节性冻土的冻结和冻融循环过程，显著影响土壤的物理化学和生物学性质，从而影响其中粪源病原菌的存活，繁殖和传播，最终进入食物链威胁人类健康。因此研究病原菌在季节性冻土中的环境行为是一个重要课题。本项目以典型季节性冻土为研究对象，以肠出血性大肠杆菌O157:H7（EcO157）为目标污染病原菌，以实验室模拟季节性冻土的冻结和冻融循环过程为方法，重点探讨EcO157在冻结和冻融循环条件下的存活与迁移规律，识别EcO157在冻结和冻融循环条件下存活的关键影响因子（如可吸收有机碳和微生物群落结构），揭示冻融循环条件下EcO157迁移的分子生物学机制（如功能基因），明确冻融循环条件下EcO157的主要毒力基因表达规律。本研究为预测季节性冻土中病原菌的环境行为，评估其可能带来的环境健康风险，控制病原菌污染提供有价值的的理论依据。

季节性冻土的冻结和冻融循环过程，显著影响土壤的物理化学和生物学性质，从而影响其中粪源病原菌的存活和传播，因此研究病原菌在季节性冻土中的环境行为是一个重要课题。本项目选取传统耕作土壤、农牧交错带土壤，及苹果梨种植土壤为研究对象，对土壤的物理化学及生物学性质，及土壤的细菌、真菌群落结构与组成做了详尽的调查与分析。模拟自然环境条件，在低温、室温、冻结、冻融循环条件下，系统的研究了大肠杆菌O157:H7在这些土壤中的存活行为（包含三个存活参数，分别是存活时间ttd，存活曲线形状参数p，及下降首个log所需时间δ），并用多种统计学手段（线性相关，多远逐步回归，聚类分析，主坐标对应分析、网络分析，结构方程）对影响其存活行为的主要环境因子进行了识别。为研究不同致病菌的存活行为，也研究了鼠伤寒沙门氏菌的存活行为。因致病菌会下渗进入含水层，本项目也对致病菌在井水中的存活行为进行了初步的研究。研究发现蔬菜土壤中细菌群落结构主要由土壤物理化学性质（pH、盐度及粘粒含量等）及土壤样品之间的距离所影响，不同土地利用类型与土壤中的细菌和真菌群落结构有显著的关联，另外在冻融循会显著影响垂直方向上的土壤物理化学及细菌真菌群落结构及组成。井水的物理化学性质（pH及有机碳含量等）会影响接种其中的鼠伤寒沙门氏菌及大肠杆菌O157的存活行为。低温（15摄氏度）下，大肠杆菌O157的存活遵循双Weibull模型，其在低温下菌群会分异为两个亚群，分别在存活实验初期和后期对存活曲线有显著影响，且两个亚群的存活行为受不同环境因子驱动。土壤冻结条件下，大肠杆菌O157的存活时间基本不受土壤物理化学性质影响，更可能受到土壤质地，及沙粒、粉粒及粘粒的含量影响。冻融循环条件下，大肠杆菌O157的存活更可能和冻融循环次数及幅度（即冻结和融化温度的差值）影响。本项目产出结果可为人致病菌的防控，降低其潜在健康风险提供科学数据支持和理论依据。