穹宇萤雌、雄发光颜色性二型的机制研究

Among Lampyridae insects, different fireflies emit different colors of light because they have slightly different luciferases, not because they have different luciferins. pH also plays an important role in colors. In the same species of fireflies, same luciferase gene is expressed in both male and female light organs and emit the same color. Recently, we discovered three species of Luciolinae fireflies Pygoluciola qingyu, Abscondita anceyi and luciola curtithorax exist sexual dimorphism in color of light when they flash besides light organ shape and number of light organs segments. Why the sexual dimorphism in color of light only occurs in the group of Luciolinae fireflies? How the sexual dimorphism in color of light occurred? Are there two different luciferases expressed differently in male and female light organs? What function is the sexual dimorphism in color of light? We wish explore the mechanism of the sexual dimorphism in color of light in firefly P. qingyu by using genome Next Generation Sequencing, gene clone, protein expression, measure of pH in light organ and observation of ultra-structure of light organs. We also wish to test the hypothesis that male and female could recognize each other by the sexual dimorphism in color of light by using manipulation of color of light organ and LEDs. In general, we wish explore the mechanism of sexual dimorphism in color of light in firefly and its function. Our research will help us to understand the origin and evolution of firefly luciferase. This research will provide another angel to understand sexual selection and flash communication in fireflies.

在萤科昆虫中，发光颜色的决定因素为荧光素酶，发光器内的pH值也是影响发光颜色的重要因素。同种萤火虫的雌、雄发光器内均表达同一种荧光素酶基因，发出同样颜色的光。近年来，申请者先后在我国的熠萤亚科中发现了3种萤火虫（穹宇萤、大端黑萤和拟纹萤），其雌、雄成虫发光颜色存在性二型性现象（雌萤发光绿色，雄萤发光黄色）。为什么仅在以闪光求偶为主的熠萤亚科中存在这种独特的雌、雄发光颜色性二型性现象？是否存在两种不同的荧光素酶基因？雌、雄发光颜色性二型在萤火虫的雌、雄求偶中有什么作用？本项目以穹宇萤为研究对象，利用分子生物学、行为学等方法，寻找并克隆荧光素酶基因，探索雌、雄发光颜色性二型的调控原理，验证其在求偶中的性别识别作用。本项目要解决一个科学问题即穹宇萤雌、雄发光颜色性二型产生的机制。本项目的研究将有助于我们理解萤火虫荧光素酶的起源及进化，也为萤火虫两性闪光交流行为、进化和性选择研究提供理论依据。

在萤科昆虫中，发光颜色的决定因素为荧光素酶，发光器内的pH值也是影响发光颜色的重要因素。同种萤火虫的雌、雄发光器内均表达同一种荧光素酶基因，发出同样颜色的光。近年来，申请者先后在我国的熠萤亚科中发现了3种萤火虫（穹宇萤、大端黑萤和拟纹萤），其雌、雄成虫发光颜色存在性二型性现象（雌萤发光绿色，雄萤发光黄色）。为什么仅在以闪光求偶为主的熠萤亚科中存在这种独特的雌、雄发光颜色性二型性现象？是否存在两种不同的荧光素酶基因？雌、雄发光颜色性二型在萤火虫的雌、雄求偶中有什么作用？通过对穹宇萤雌虫、雄虫不同形态下发光器发光光谱的研究，初步表明发光器表皮结构不影响发光光谱；且雌雄幼虫的发光底物荧光素无差异。通过对穹宇萤雌、雄发光器结构的切片观察分析，二者在结构上基本相同，无显著差别。通过穹宇萤荧光素基因Luc1蛋白体外表达研究，表明一定范围内pH对其发光光谱无影响。通过穹宇萤基因组三代de novo测序，发现了3条萤火虫luc1基因同源序列。通过southern blot杂交，发现穹宇萤Luc1基因有3个拷贝，这些基因在3’端高度保守，而在编码区中上游有一定的差异。三代全长转录组测序，调取到穹宇萤雌、雄、幼各自特异luc1序列，这些序列高度同源但又有多个突变位点。分别克隆验证穹宇萤的3条luc1序列，确认转录组测序结果无误；证实雌性穹宇萤发光器内同时表达两种荧光素酶基因luc1，即Pqluc1-M,Pqluc1-F分别克隆不同的luc1基因，进行原核蛋白表达与体外发给特征检测，这些蛋白的发光特征不受pH值影响（pH4-10）,且Pqluc1-M,Pqluc1-L发光特征不同，与活体测量的光谱基本一致（Pqluc1-F正在进行蛋白表达实验）。 综上所述，排除发光底物荧光素、发光器结构、pH等影响因素后，初步证实不同荧光素酶蛋白的特异性表达，是引起穹宇萤雌、雄、幼个体发光颜色不同的原因所在。也在全世界第一次发现了同一种萤火虫个体发光器发光颜色不同、且特异性表达3个不同荧光素酶基因的现象，为萤火虫荧光素酶基因的进化提供了全新的思路。