灰黄青霉吲哚生物碱类次生代谢产物及其免疫抑制活性的研究

Protein kinase C (PKC)-θ is a member of the PKC family, which consider to be a potential drug target for autoimmune diseases. It is a key regulator in signal transduction in TCR/CD28 pathway and the expression of IL-2, and also plays a critical role on activation, proliferation and survival of mature T cells. The chemical study of the extract from the fungus Penicillium griseofulvum lead to the discovery of two novel indole alkaloids. Among them, compound 1 shows significant inhibition of PKC-θ based on the Reverse Virtual Screening and evaluation of in vitro biological activity. In order to discover bioactive leading compounds, a systematic research of P. griseofulvum from different sources uncovered by OSMAC method, epigenetic regulation, Reverse Virtual Screening and in vitro test will be performed in this project. According to the results of PKC-θ inhibitor activities, the mechanism action of bioactive molecular finally will be elucidated. The project will greatly promote the discovery of effective immunosuppressant for the treatment of autoimmune diseases.

PKC-θ是蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的θ亚型，其参与T细胞受体（TCR）和共刺激分子CD28介导的信号整合，调控白细胞介素IL-2的表达，对成熟T细胞的活化、增殖和存活发挥重要的作用，是自身免疫疾病的主要作用靶点。申请者前期从灰黄青霉提取物中分离得到两个结构新颖的吲哚生物碱类新骨架化合物，通过计算机模拟分子对接方法以及体外酶活性验证，发现其中化合物1具有较强的PKC-θ酶抑制作用。本项目拟通过OSMAC策略筛选优化的发酵条件，运用表观遗传学手段调控基因表达，充分挖掘不同来源的灰黄青霉中吲哚生物碱类化合物。采用计算机反向虚拟筛选技术和体外活性测试筛选具有PKC-θ酶抑制活性的先导化合物，进一步运用分子生物学、细胞生物学和药理学方法探索活性化合物的作用机制。该项目的顺利实施对发现新的小分子免疫抑制剂,并用于自身免疫类疾病的治疗具有重要的意义。

免疫抑制剂是对机体的免疫反应具有抑制作用的药物，用于抑制与免疫反应有关的T细胞和B细胞等巨噬细胞的增殖和功能，降低抗体免疫反应，从而降低和阻止免疫力表达异常对机体正常组织的攻击造成的机体损害，其在包括自身免疫类疾病的治疗和器官、骨髓移植中发挥着至关重要的作用。而目前临床上使用的免疫抑制剂在发挥免疫抑制功能的同时也表现出多种不良反应，具有较强的细胞毒性，造成广泛的免疫功能抑制，具有威胁生命的毒副作用。因此，本研究通过OSMAC策略筛选优化的发酵条件，运用表观遗传学手段调控基因表达，充分挖掘青霉属真菌中的生物碱类次级代谢产物，从中发现新的且毒副作用小的小分子免疫抑制剂。通过该项目的实施，我们从灰黄青霉和变灰青霉的发酵产物中分离、鉴定得到了生物碱和聚酮类的化合物超过50个，新化合物20个，其中新骨架化合物10个。部分化合物表现出较强的免疫抑制活性，其中二酮哌嗪类新骨架化合物janthinolide C对CD3/ CD28抗体诱导的小鼠脾细胞增殖具有较强的抑制作用，IC50达到1.30 μM，而对LPS诱导的小鼠脾细胞增殖没有表现出抑制作用，表明此化合物具有选择性的免疫抑制作用，并且在同等浓度下该化合物对正常的小鼠脾细胞没有细胞毒性，该研究结果值得进一步的深入研究。此外，聚酮类新骨架化合物(−)-canescone C对免疫抑制靶点蛋白PTP1B表现出较强的活性，IC50达到9.42 μM，我们运用了分子模拟对接技术对其结合位点进行分析以讨论活性与分子结构之间的关系。综合以上研究结果，该项目的顺利实施对发现新的小分子免疫抑制剂,并用于自身免疫类疾病的治疗具有积极的意义。