家蚕性别决定同源基因Sxl的克隆及功能研究

The Sxl gene is a key switch gene in sex determination of the model insect Drosophila, which regulates its downstream target gene tra. Sxl homologue is present in silkworm, but there is no tra gene. The function of Sxl gene in insects other than Drosophila remains unclear. The project is planned by RT-PCR, quantitative PCR to detect Sxl gene expression profiling in the silkworm male and female early embryos as well as the main tissues, and study sexual differentially expressed profiles of silkworm Sxl gene. Further, using EMSA and ITC methods, we investigate and identify the target sequence and key sites of binding by silkworm SXL protein. According to target sequence information, we search silkworm genome sequences and can get the downstream target genes of Bombyx mori SXL protein regulatio; Finally, we identify silkworm Sxl function phenotypes by RNAi and transgenic overexpression.

Sxl基因是模式昆虫果蝇性别决定的关键开关基因，调控下游靶基因tra。家蚕具有Sxl同源基因，但不存在tra基因。Sxl基因在果蝇以外昆虫中的功能仍不清楚。本项目拟通过RT-PCR、荧光定量PCR等检测Sxl基因在家蚕雌雄胚胎早期以及主要组织表达谱，研究家蚕Sxl基因雌雄表达差异概况；进一步，利用凝胶阻滞和等温滴定微量热方法，筛查和鉴定家蚕SXL蛋白结合靶序列及关键位点；利用靶序列信息检索家蚕基因组，获得家蚕SXL蛋白调控的下游靶基因；最后，通过RNAi、转基因过量表达方法获得Sxl功能表型特征。

家蚕性别决定一直以来是产业上的重要课题，其调控机制与模式昆虫果蝇相比，既具有共同性也有特殊性。Sxl基因是果蝇性别决定的关键开关基因，以前观点认为Sxl在非果蝇属的昆虫中却不参与性别决定调控。.本项目克隆了Sxl基因在家蚕中的同源基因（BmSxl），对BmSxl基因进行了胚胎早期和幼虫主要组织的表达谱检测。诱导、表达及纯化了BmSxl蛋白，对下游靶序列及关键结合位点进行了研究，鉴定了下游靶基因。进行了BmSxl蛋白的组织免疫组化，鉴定了BmSxl蛋白质核定位信号。进行了BmSxl基因的RNA干涉研究。研究结果发现BmSxl参与了家蚕性别决定途径，其通过直接调控家蚕Bmdsx基因的剪接从而参与家蚕性别决定，调控结合的关键位点为Bmdsx 第三内含子3’剪接位点附近多聚“U”序列。其次，鉴定了家蚕BmSxl的选择性剪接，其产生2种mRNA形式（命名为BmSxl-PA和BmSxl-PB），BmSxl-PA形式编码的蛋白质位于细胞核内，BmSxl-PB蛋白质位于细胞质中，核定位信号位于BmSxl-PA的C末端。最后，揭示了其在家蚕性别决定中的调控机制，位于细胞核内的BmSxl-PA蛋白质形式调控Bmdsx基因，位于细胞质中的BmSxl-PB蛋白质形式调控Nanos基因。BmSxl蛋白同时调控自身剪接。项目发表学术论文6篇，其中SCI论文4篇。培养研究生毕业4名。.家蚕性别决定调控途径目前还没有完全阐明，尤其是有哪些调控因子参与了调控Bmdsx雌雄特异剪接仍有待被鉴定。本项目鉴定和发现了BmSxl参与家蚕性别决定途径，这一结果有助于我们进一步理解和阐明家蚕性别决定机制。另外，发现BmSxl直接调控家蚕Bmdsx基因（Sxl→dsx）从而参与家蚕的性别决定，这与果蝇性别决定途径（Sxl→tra→dsx）相比，两者呈现有趣的差异。这也为我们理解昆虫性别决定途径及进化提供了新的认识。