在心肌细胞以钙调蛋白的N端和C端白对兰尼碱受体结构和功能的研究，以及相关心衰和心律失常的影响

The cardiac ryanodine receptor (RyR2), the intracellular Ca release channel, plays a central role in excitation-contraction coupling (ECC). A dysfunctional RyR2, exhibiting enhanced diastolic sarcoplasmic reticulum(SR) calcium(Ca) leak, has been implicated in arrhythmogenesis and heart failure (HF). calmodulin (CaM) has been long identified as an important cardiac RyR2 regulator. Broad studies suggest CaM is a critical RyR2 stabilizer which inhibits RyR2 opening and prevents SR Ca leak. In HF, CaM could be dissociated from RyR2. Without CaM inhibition, RyR2 leads to enhenced SR leaking. This pathological leaking can impair heart contractility, cause cardiac hypertrophy, results in arrhythmia and cardio sudden death. So the CaM-RyR2 interaction is a critical molecular substrate for arrhythmias and HF pathogenesis...In this study, we novelly split the whole CaM into two structural and functional unit, C and N lobe. Both lobes will be fluorescently labeled. We also use fluorescent FKBP12.6 to label RyR2. Then through FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), it provides the opportunity to study the C and N lobes' interaction with RyR2 separately in structural aspect. For the functional aspect, Ca spark and wave measurement, single channel recording will be applied to assess both lobes' functional regulations on RyR2. Finally, we will extend the studies to pathology level. We will quantify the binding affinity change of N, C lobe with RyR2 in HF cardiomyocytes. . .The accomplishment of this project will enrich our understanding about RyR2-CaM interaction and functional effects on RyR-mediated Ca release in cardiac myocytes. This will also expand our knowledge of molecular mechanisms that underlie arrhythmogenesis and HF. Importantly, it will pinpoint a potential molecular target responsible for Ca triggered arrhythmias in HF and eventually be translated into the development of novel therapeutic strategies.

最新研究表明兰尼碱受体介导的病理性肌浆网钙渗漏可以导致心肌收缩力下降、心肌肥大、心律失常和心源性猝死。在上述病理机制中钙调蛋白对兰尼碱受体的调控是非常重要的。钙调蛋白是兰尼碱受体附属结合蛋白，对受体起抑制作用和稳定兰尼碱受体在关闭状态防止病理性钙渗漏。在心衰时钙调蛋白和兰尼碱受体的结合力减弱而使受体失去钙调蛋白的抑制，从而导致病理性肌浆网钙渗漏。所以钙调蛋白和兰尼碱受体的相互作用是目前治疗心衰、防治心律失常的重要研究对象。本项研究把钙调蛋白分割成N 和 C端两个基本结构功能单位，并利用最新荧光共振能量转移（FRET）的技术，分别具体地研究钙调蛋白这两个基团对兰尼碱受体结构和功能方面的作用。从结构和功能的角度全面研究钙调蛋白对兰尼碱受体的作用机制。这些进一步的研究可以让我们更好的理解心衰和心律失常的分子病理基础，以发现更新的治疗靶点和提出更可靠、先进的治疗手段。

兰尼碱受体介导的病理性肌浆网钙渗漏可以导致心肌收缩力下降、心肌肥大、心律失常和心源性猝死。在上述病理机制中，钙调蛋白作为兰尼碱受体结合蛋白，对受体起抑制作用和稳定兰尼碱受体在关闭状态防止病理性钙渗漏。在心衰或者遗传性心律失常时钙调蛋白和兰尼碱受体的结合力减弱而使受体失去钙调蛋白对受体的抑制，从而导致病理性肌浆网钙渗漏。所以钙调蛋白和兰尼碱受体的相互作用是目前治疗心衰、防治心律失常的重要研究对象。钙调蛋白是由N端和C端组成的哑铃状结构，N端和C端具有不同的钙结合力同时也可以结合在兰尼碱受体的不同位置，从而产生不同的调节功能。本项研究把钙调蛋白分割成N 和 C端两个基本结构功能单位，并利用最新荧光共振能量转移（FRET）的技术，分别具体地研究钙调蛋白这两个基团对兰尼碱受体结构和功能方面的作用。通过大肠杆菌表达和纯化以及单分子标记技术，我们得到荧光标记的钙调蛋白N端（1-81AA）和C端（77-149AA）。通过荧光共振能量转移的技术，我们分别测量了钙调蛋白的N端和C端对兰尼碱受体的结合情况，N端在基础情况下是紧密结合，C端在基础情况是松散链接。而在病理条件下，在CPVT基因敲入RyR A165D小鼠心肌细胞，钙调蛋白的N片段和RyR的结合力减弱。在胸主动脉窄缩的心衰小鼠模型中，钙调蛋白的N片段及C片段和RyR的结合力都明显减弱。在功能测试方面，增加钙调蛋白N端和兰尼碱受体的结合可以抑制RyR A165D小鼠全细胞钙波的形成，从而抑制触发活动的产生。本项研究从结构和功能的角度进一步阐明了钙调蛋白对兰尼碱受体的作用机制。这些结果可以让我们更好的理解心衰和心律失常的分子病理基础，以发现更新的治疗靶点和提出更可靠、先进的治疗手段。