慢病毒介导的HIF-1α基因调控hMSCs向髓核细胞分化及表型的表观遗传机制

骨髓间充质干细胞（MSCs）作为细胞移植种子细胞，体外可诱导向髓核样细胞分化。对hMSCs进行基因修饰，精确调控MSCs向NPCs分化及表型是目前研究焦点。本研究通过慢病毒介导HIF-1α基因转染hMSCs，模拟椎间盘缺氧微环境，在原位交联透明质酸/甲基胶原三维细胞培养系统培养，使HIF-1α持续表达，诱导hMSCs向hNPCs分化；采用MeDIP-Chip和CHIP-Chip等芯片技术，寻找启动子H3K4me3,H3K9me3和DNA甲基化与基因表达谱变化趋势相一致的基因，生物信息功能分类选出与干细胞分化或低氧相关的基因，利用MeDIP-PCR和ChIP-PCR等进行验证，阐明低氧环境中HIF-1α促进MSCs向NPCs分化及表型的表观遗传学机理，为定向诱导hMSCs长期稳定地向hNPCs分化，获得椎间盘移植理想的种子细胞提供研究证据，对阻止椎间盘退变的病理进程、促进再生具有重要的意义。

腰椎间盘退变性疾病是下腰痛的主要原因，目前理疗、药物、手术等临床治疗方法效果十分有限，因而寻求有效的治疗方式具有重要的学术价值和临床意义。骨髓间充质干细胞（MSCs）体外可诱导向类髓核样细胞（NPCs）分化，对MSCs进行基因修饰，精确调控其向NPCs分化及表型是目前研究焦点。本项目获得以下几个方面重要研究结果：（1）突破了人工髓核材料合成中的三个关键技术：交联剂PEGDA的合成、巯基化试剂DTP的合成和透明质酸巯基化等，以细胞外基质（ECM）主要成分透明质酸和硫酸软骨素为原料经化学原位交联合成类细胞外基质，成功制备了可注射性原位交联人工髓核（水凝胶）；静态与动态生物力学检测材料本身和它构成的椎间盘功能单位的生物力学特性，显示其具备良好的粘弹性，可恢复髓核摘除后椎间盘的生物力学特性；人工髓核能促进MSCs增殖，具有良好的生物相容性；（2）成功进行慢病毒包装并感染MSCs，将HIF-lα成功导入和构建稳定株；模拟椎间盘生理低氧条件，在髓核仿生外基质中诱导MSCs分化，证实具NPCs的特征基因及细胞表型表达；（3）通过模拟ECM的主要成分，成功筛选出适合干细胞培养分化的最佳材料合成构建仿生髓核，体外结果表明其具有协同MSCs定向诱导成为NPCs的特性；将水凝胶应用在恒河猴椎间盘终板退变模型中，利用T1ρ-MR分子影像平台进行无创、定量监测体内细胞外基质的合成代谢，评估髓核修复效果；（4）通过DNA甲基化和miRNAs表达谱的研究，明确表观遗传学调控在MSCs分化中的重要作用：采用DNA甲基化芯片和基因芯片联合分析MSCs向NPCs分化早期受甲基化调控的基因并进行验证，结果发现多个受甲基化调控、参与干细胞分化的基因及参与的多个细胞信号通路；建立脊柱融合大动物模型并筛选与MSCs骨向分化相关的microRNAs表达谱；（5）同时检测到与甲基化状态改变的相关基因（NFATc1）可在低氧培养下表达升高；为明确其调控机制，课题还深入探讨HIF与甲基化酶Dnmt3b之间的关系，揭示细胞在分化过程中的表观遗传学调控机制。本项目所取得的成果不但为基因修饰MSCs，精确调控其向NPCs分化及表型提供理论依据，而且为椎间盘退变的生物治疗奠定了物质基础，同时加深了我们对椎间盘退变微环境下细胞生存、分化的认识，为今后椎间盘退变研究提供了细胞及动物模型，开拓了干细胞分化研究新的方向。