基于多肽的真菌毒素全抗原模拟物结构重建及其免疫学分析特性的分子机制

Chemical synthesis of mycotoxin conjugates is the technique bottleneck of the development of immunoassay method and its large-scale application in detection of mycotoxins. In this study, we intend to use peptide as core element to develop and reconstruct of mycotoxin conjugates mimics based on our previous research works of mycotoxin mimotope. First, we are trying to construct a mycotoxin mimotope mutant library and select peptide molecules with different affinity constant of anti-mycotoxin antibodies by various biopanning strategy. After that, molecular electronegativity -distance vector(MEDV) is proposed to characterize the structure of peptide molecules and elucidate the structue-activity relationship .In addition, peptide molecules and scaffold were combined by computer molecular modeling to construct mycotoxin conjugate peptide mimics, and the influence mechanism of motif , flexibility and conformation domain on antibody detection performance were analyzed. Furthermore, to large-scale preparation of peptide mimics, the gene of coding peptide will be transferred to express vector and express peptide-scaffold fusion protein and applied in different type immunoassay . The final goal of this study is to provide the theoretical and methodological support for the peptide applied to biosynthesis of complete conjugates of toxic small molecules.

全抗原(包被及竞争抗原)的化学合成制备已成为建立真菌毒素免疫学分析体系及规模化应用的技术瓶颈之一。本研究拟在获得真菌毒素半抗原模拟表位的前期工作基础上，以多肽分子为核心元件，开展真菌毒素全抗原模拟物的结构重建。通过半抗原突变库的构建及差异化淘选，获取与抗体具有不同结合平衡常数Ka数值的多肽分子；并用分子电距矢量（MEDV）表征多肽的分子结构特征并构建其定量构效关系模型，分析其空间结构域变化对其亲和能力的影响；同时采用分子模拟方法将多肽分子与不同的骨架蛋白进行模拟嵌合，构建基于肽模拟的真菌毒素全抗原模拟物；探析模拟物的基序、柔性度以及空间结构域对抗体分子识别取向、特异性及灵敏度的影响机制；在此基础上，通过基因工程的方法进行真菌毒素全抗原模拟物的生物合成，探析其免疫分析性能的稳定性，并应用于不同免疫学检测模式。研究成果对其它有毒小分子物质全抗原模拟物的生物制备也具有积极的示范意义。

传统的小分子化学污染物的全抗原制备需以小分子半抗原为原料进行化学合成，面临制备成本高、操作毒害以及环境污染等多种挑战。发展无毒、无害的绿色免疫分析体系是当前小分子化学污染物免疫分析体系发展的必然趋势及现实需求，并已成为当前食品安全、免疫分析学交叉研究领域的主要挑战之一。本项目以食品中常见的真菌毒素作为研究模型，以多肽分子/纳米抗体为核心元件，通过定向淘选与计算机化学技术，获得了多种食品中常见真菌毒素（赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B1、呕吐毒素、黄曲霉毒素B1）的半抗原模拟表位，经过DNA测序及ELISA、SPR分析确定了抗原模拟表位的氨基酸组成以及核心基序，解决了食品中常见真菌毒素半抗原的无害化替代这个关键问题。在此基础上，通过基因克隆及原核生物表达，以抗原模拟表位-MBP（麦芽糖结合蛋白）的形式功能化定向构建了真菌毒素的全抗原模拟物（融合蛋白），并实现了全抗原模拟物在原核生物体系的生物合成。将真菌毒素全抗原模拟物作为传统化学合成全抗原的替代物应用于真菌毒素的免疫分析体系(ELISA、胶体金免疫层析、酶联斑点免疫)，建立了真菌毒素的高灵敏、低成本型绿色免疫分析新模式。本项目的研究成果对于食品中其它有毒小分子化学污染物的绿色免疫分析模式的建立也具有积极的示范意义。