甘草酸单铵抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒穿入MARC-145细胞膜的机制研究

Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is one of the most economically important diseases that endanger pig industry worldwide. Glycyrrhizin is extracted from licorice, an active component having multiple biological activities. Previous studies have shown that glycyrrhizin possess broad-spectrum antiviral activity, and a variety of antiviral mechanisms. Previously, we found that glycyrrhizate monoammonium significantly reduced PRRSV proliferation and mainly inhibits the penetration stage of PRRSV in its life cycle. However, the molecular mechanism of glycyrrhizin inhibits PRRSV internalization remains unclear. In this project, we aim to (i) investigate the role of lipid raft-dependent endocytosis pathway and clathrin-mediated pathway in the process of PRRSV enter MARC-145 cells using RNA interference and fluorescence quantitative RT-PCR methods; (ii) evaluate the effects of glycyrrhizate monoammonium on lipid rafts, membrane fluidity, clathrin, membrane potential and ion channel, and to explore the potential role of these factors in PRRSV penetration; (iii) determine the molecular targets of glycyrrhizin by using the methods of fluorescein labeling, transcriptomics analysis and isothermal titration calorimetry. Completion of this project will provide comprehensive understanding of PRRSV penetration mechanism, and provide a theoretical basis for the development of effective anti-PRRSV drugs.

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是严重危害养猪业的病毒性传染病。甘草酸（Glycyrrhizin）是从中药甘草中提取出来的一种重要的活性成分。研究表明，甘草酸及其衍生物有广谱抗病毒活性，且抗病毒机制多样。前期研究发现，甘草酸单铵能显著抑制PRRS病毒（PRRSV）增殖，且主要抑制PRRSV复制周期的穿入阶段，但其作用机制尚不清楚。本项目拟进一步采用RNA干扰、荧光定量RT-PCR等技术，分析网格蛋白和脂筏依赖性胞吞通路在PRRSV进入细胞中的作用，结合甘草酸单铵对细胞膜脂质筏、膜流动性、网格蛋白、细胞膜电位、离子通道的影响，探讨甘草酸单铵影响PRRSV进入细胞的因素。同时，使用荧光素标记、转录组学分析、等温滴定量热法等技术挖掘甘草酸单铵的作用靶点，从分子水平上解析甘草酸单铵抑制PRRSV穿入MARC-145细胞膜的机制，研究结果可以为研制高效的抗PRRSV药物提供理论依据。

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），由PRRS病毒（PRRSV）引起，是严重危害养猪业的病毒性传染病。非洲绿猴肾细胞系MARC-145对PRRSV敏感，是PRRSV体外研究中常用的细胞。前期研究发现，甘草酸，从中药甘草中提取出来的一种重要的活性成分，能显著抑制PRRSV在MARC-145细胞中增殖，且主要抑制PRRSV复制周期的穿入阶段，但其作用机制尚不清楚。本试验进一步通过转录组学和荧光定量RT-PCR检测发现甘草酸单铵降低PRRSV引起的钾离子通道蛋白KCNJ5和KCNJ9，钙离子通道蛋白MidA和CaV1.3等基因表达。细胞生长周期检测发现，PRRSV感染首先增加G1期的MARC-145细胞含量，然后降低G1期的细胞含量，而甘草酸单铵能影响PRRSV对细胞周期的调节作用。结果还发现PRRSV在G0/G1期MARC-145细胞中的增殖滴度最高，且甘草酸单铵也能降低PRRSV在同步化MARC-145细胞中的含量。ATP酶检测结果发现，PRRSV感染使MARC-145细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性降低，而甘草酸单铵能显著提高感染PRRSV的MARC-145细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性，并且在PRRSV感染状态下，甘草酸单铵对MARC-145细胞ATP酶的调控作用更强。荧光漂白恢复结果显示，PRRSV感染使MARC-145细胞膜的流动性升高，而甘草酸单铵使MARC-145细胞膜的流动性降低。通过DiBAC4(3)染色检测细胞膜电位，结果发现PRRSV感染使MARC-145细胞膜电位降低，而甘草酸单铵能使降低的膜电位升高。甘草酸单铵可通过多种途径调控PRRSV感染MARC-145细胞的功能，以上结果为阐明甘草酸单铵抑制PRRSV在MARC-145细胞中增殖的机制提供一定的理论支持，为甘草酸的开发利用及临床治疗PRRSV感染提供一定的参考依据。