基于SIP和单细胞技术的磺胺类抗生素微生物降解机制研究

Sulfonamide antibiotics and sulfonamide antibiotic resistant genes, receive more and more concerns in the world, due to their potential adverse effects on environmental ecosystems and public health. Biodegradation is one of the important pathways for the removal of sulfonamide antibiotics in the environments. So it is useful and necessary to evaluate degrading microbes and their biodegradation mechanisms of sulfonamide antibiotics in the sludge of wastewater treatment systems and lake sediments. However, traditional enrichment method may miss important but uncultivable degrading microbes. The objectives of this project are (1) to evaluate the degrading microbes of sulfamethoxazole which can use sulfamethoxazole as the carbon source in wastewater treatment plants and lake sediments by using DNA-stable isotope probe technique (DNA-SIP) and 13C-sulfamethoxazole as the substrate; (2) to obtain single-cell degrading microbes of sulfonamide antibiotics and their metagenomes by using single cell sorting technique, single cell amplification and sequencing, and evaluate their functional genes and biodegradation mechanisms of sulfonamide antibiotics at gene level; then to verify the biodegradation pathways and mechanisms of sulfonamide antibiotics by obtained degrading microbes by culturing the single cell degrading microorganisms, and doing the biodegradation experiments . The project would explore ecological mechanisms of biodegradation of sulfonamide antibiotics, and improve the usage of single cell technologies to investigate the biotransformation mechanisms of organic pollutants at gene level and single-cell ecophysiology of biodegrading microbes, and also enrich the antibiotic pollution ecology.

磺胺类抗生素及其耐药基因因其生态和人体健康风险而成为全球关注的重大环境问题。微生物降解是环境中磺胺类抗生素去除的主要途径，研究污水处理厂活性污泥和湖泊沉积物中磺胺类抗生素降解菌种类及分子学降解机制具有重要意义。然而，传统的分离培养方法难以对不可培养但重要的降解菌加以研究。本项目拟以13C-磺胺甲噁唑为底物，利用稳定同位素核酸探针技术(DNA-SIP)研究污水处理厂活性污泥和湖泊沉积物中可利用磺胺甲噁唑为碳源的降解菌种类及群落结构；利用单细胞分离技术获得单细胞降解菌，并进行单细胞扩增和宏基因组测序，分析对应的功能基因及基因组水平的降解机制。尝试扩大培养单细胞降解菌，并进一步验证降解途径及分子水平的降解机制。研究结果有助于深入了解人工和自然环境中磺胺类抗生素微生物降解的微生物生态学机制，同时完善利用单细胞技术研究有机污染物降解菌的生理生态信息及基因水平的降解机制，丰富抗生素污染生态学。

抗生素和杀生剂在污水处理厂和地表水中普遍存在。微生物降解是多种抗生素和杀生剂去除的重要途径，而多种微污染物尤其是磺胺类抗生素的去除与氨氧化速率密切相关。本项目通过室内添加实验，开展三类氨氧化微生物氨氧化古菌N.gargensis、氨氧化细菌N.nitrosa Nm90和完全氨氧化菌N.inopinata降解磺胺类、林可霉素和氟喹诺酮类抗生素的微生物降解机制研究。研究发现，氨氧化古菌、氨氧化细菌和完全氨氧化菌均通过共代谢方式降解多种磺胺类抗生素，氨氧化古菌和完全氨氧化菌均可降解林可霉素，氨氧化古菌和氨氧化细菌均可降解氟喹诺酮类抗生素。磺胺类抗生素的主要降解过程为脱氨基、羟基化和硝化过程等；LIN主要发生羟基化、S-氧化、去甲基化和去甲硫基化过程；氟喹诺酮类抗生素环丙沙星和诺氟沙星的哌嗪环发生裂解或亚硝化。同时研究了多种苯并咪唑类杀菌剂被氨氧化微生物降解的作用机制。研究发现，多菌灵仅在N.inopinata以氨为底物时发生降解，说明完全氨氧化菌N.inopinata降解多菌灵时主要在氨氧化过程相关的酶作用下发生；降解产物是多菌灵苯环处进行羟基化作用产生的，这也与氨氧化单加氧酶作用一致。两种氨氧化微生物N.inopinata和Ca.N.kreftii均能降解四种苯并咪唑类物质（包括苯并咪唑、阿苯达唑、多菌灵和麦穗灵），衍生物不同的官能团可能会影响完全氨氧化微生物降解该类污染物的活性，降解产物可能主要通过羟基化、脱烷基和糖苷化等过程形成。上述发现为阐述不同氨氧化微生物及其氨氧化中间产物在污水处理厂和地表水硝化环境中对微污染物的生物转化作用提供了重要的基础数据。同时，开展湖泊沉积物中杀生剂尼泊金甲酯微生物降解的降解动力学过程研究，并尝试利用稳定同位素探针技术识别湖泊沉积物中尼泊金甲酯的降解菌，为地表水环境中微污染物生态风险评价和污染控制提供基础数据和理论支持。