新型多肽化聚合物刷的构建及其检测基质金属蛋白酶的性能研究

Peptide-functionalized polymer brushes are hot spots in research due to their high peptide load capacity and they are able to maintain the bioactivity of peptides. This research proposal aims to develop novel peptide-functionalized polymer brushes with low non-specific adsorption of serum proteins and sensitive response to matrix metalloproteinase (MMP-2/9). First, the polymer brushes of poly(sodium methacrylate) (P(MA-Na)) would be grafted on silica nanoparticles via surface initiated atom transfer radical polymerization (SI-ATRP). The P(MA-Na) polymer brushes would be further functionalized by immobilizing FITC-labeled peptides as probes for detecting MMP-2/9. Once the peptide is cleaved, the peptide fragments containing FITC is released to the solution and can be subsequently detected by using a fluorescence microscope. Second, this research proposal also aims to study the role of polyethylene glycol (PEG) in the polymer brushes to reduce nonspecific adsorption of serum proteins and to regulate the protease activity. This research would provide new approaches for further understanding the interactions between polymer brushes and matrix metalloproteinase, which would promote the application of polymer brushes in clinical diagnoses of major diseases.

多肽化聚合物刷不仅能够保留多肽的生物活性，还具有多肽固定量高的优点，是医用高分子科学领域的研究热点。本项目以申请人的前期研究为基础，提出构建多肽固定量可控、抗血清蛋白非特异性吸附、并对基质金属蛋白酶（MMP-2/9）具有高响应性的新型多肽化聚合物刷，使其具有在复杂介质（如血清）中灵敏检测基质金属蛋白酶的特性。首先，拟基于ATRP法在SiO2纳米颗粒表面构建聚甲基丙烯酸钠（P(MA-Na)）聚合物刷，初步探讨荧光标记的多肽在聚合物刷的固定性能及其对MMP-2/9的响应能力。其次，拟通过无规共聚在P(MA-Na)聚合物刷中引入聚乙二醇（PEG）链段以降低蛋白质非特异性吸附、调控多肽的固定量，并研究PEG链段对MMP-2/9酶促反应动力学的影响机制。本项目可有助于进一步理解多肽化聚合物刷与基质金属蛋白酶的相互作用机制，从而为构建新型高灵敏度蛋白酶检测手段提供新的理论基础和科学依据。

蛋白酶广泛存在于生物体中，对调节生物体的生理机能起到重要作用。同时，蛋白酶的异常表达通常会伴随多种疾病的发生，因此，蛋白酶类生物分子的快速、高灵敏诊断在临床上具有重要意义。本项目利用表面引发ATRP法，在SiO2纳米颗粒表面成功构建了聚甲基丙烯酸钠（PMAA）聚合物刷，并分别用XPS、热重等手段对聚合物刷及后续多肽功能化进行表征。研究了不同PMAA聚合物刷的固定量对多肽接枝度的影响。结果表明多肽固定的表面密度与SiO2纳米颗粒表面的PMAA聚合物刷的接枝量密切相关，并以此确定ATRP反应中甲基丙烯酸钠单体（MAA）的最佳浓度。以胰蛋白酶为模型，研究了多肽功能化的PMAA聚合物刷在蛋白酶检测中的应用。研究结果表明，该方法在Tris缓冲溶液（pH 8.0）与牛血清中检测胰蛋白酶的最低检测极限（LOD=3SD/sensitivity）分别为1.4 pM和2.6 nM。另外，以胰蛋白酶和糜蛋白酶为模型分子，多肽功能化的PMAA聚合物刷对检测蛋白酶具有很好的特异性。之后，以基质金属蛋白酶（MMP-2）为例，验证了多肽功能化的PMAA聚合物刷在蛋白酶检测中的普适性。该方法检测MMP-2的最低检测极限为1.1 pM。在玻璃基板表面构建聚丙烯酰胺凝胶微阵列和聚乙二醇（PEG）微柱环（图5）。当PMAA聚合物刷上的多肽底物被蛋白酶水解，释放出的多肽残基（GGK-FITC）可以进入聚丙烯酰胺凝胶微阵列的高分子网孔，从而实现多肽残基的分离与蛋白酶检测（LOD=157 pM）。通过在凝胶微阵列高分子骨架中引入环糊精（CD），同时在多肽残基中引入金刚烷（Ad）基团，利用Ad-CD超分子自组装作用可以进一步提高蛋白酶检测的灵敏度。