LRP6对心脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

LRP6 is a member of the low-density lipoprotein receptor family and plays a crucial role in heart development, whether it involved in myocardial ischemia/reperfusion injury is unclear. Recently, we observed that cardiac-specific LRP6 overexpression reduced myocardial infarct size induced by ischemia/reperfusion in mice, suggesting LRP6 may protect heart against ischemia/reperfusion injury. Our previous study found that knockdown of LRP6 may activate DRP1 and induce DRP1 translocate from the cytosol to the mitochondria. Emerging evidences suggested that I/R activates DRP1 and induces DRP1 translocate from the cytosol to the mitochondria, resulting in excessive mitochondrial fission and mitochondrial fragmentation, which may induce apoptosis and contribute to ischemia/reperfusion injury and heart failure. Inhibition of DRP1 hyperactivation is sufficient to reduce tissue damage caused by ischemia/reperfusion injury through inhibiting mitochondrial permeability transition pore opening, decreasing ROS production, and reducing mitochondrial metabolism during I/R. Therefore, we speculate that LRP6 exerts a protective effect on ischemia/reperfusion injury by inhibiting DRP1 translocate to mitochondria, reducing excessive mitochondrial fission and mitochondrial fragmentation, and preventing apoptosis of cardiomyocytes. We will use cell biology techniques, molecular biology techniques and genetic engineering to verify the hypothesis by cardiac-specific LRP6 overexpression mice and lentivirus to regulate the expression of LRP6 in cardiomyocytes. The study will elucidate the protective mechanism of LRP6 on ischemia/reperfusion injury and provide a new target for the treatment of ischemic heart disease.

LRP6参与心脏发育，但其是否参与心脏缺血再灌注损伤及可能的机制未明。我们发现，在心脏缺血再灌注模型中，心肌特异性LRP6过表达小鼠梗死面积明显降低，提示LRP6发挥了保护作用。此外我们发现，LRP6可以调控线粒体分裂蛋白DRP1的磷酸化及线粒体转位。目前有研究报道，在心脏缺血再灌注损伤过程中，DRP1被激活，引起细胞凋亡。而抑制DRP1可以减轻心脏缺血再灌注损伤，减小梗死面积。我们推测，LRP6可能通过抑制DRP1向线粒体转位、抑制线粒体异常分裂及片段化、减少心肌细胞凋亡，发挥对心脏缺血再灌注损伤的保护作用。我们将在体内外采用诱导型心肌特异性LRP6转基因小鼠，慢病毒过表达或干扰手段，综合运用细胞生物学、分子生物学和基因工程等技术验证这一假设。该研究将阐明 LRP6对心脏缺血再灌注损伤的保护机制，为缺血性心脏病的治疗提供新的靶点。

低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）是经典的Wnt信号通路重要的共受体，参与多种功能。我们最近报道扩张型心肌病患者的心脏中LRP6表达下降，而小鼠心肌细胞特异性LRP6敲除通过激活发动相关蛋白1（Drp1）导致心脏功能障碍。但LRP6是否参与心脏缺血再灌注损伤及其可能的机制未明。本研究中我们通过构建C57BL/6小鼠心脏缺血再灌注（I/R）模型，发现在再灌注15、30分钟时间点心脏p-LRP6水平升高。通过对心肌细胞特异性LRP6转基因小鼠和同窝对照Cre小鼠构建心脏I/R模型，发现小鼠心肌特异性LRP6过表达改善心脏I/R术后24小时和术后2周的心功能，降低心脏I/R术后24小时梗死面积以及减少Tunel染色阳性细胞，且相应组织蛋白的active-caspase3表达下降。进一步研究发现，心肌特异性LRP6过表达使HSF1在细胞核内的表达水平明显升高，总蛋白p-GSK3β(S9)、p-AMPK水平也升高。使用腺病毒感染AC16细胞使其过表达LRP6，再用HSF1 siRNA干扰，并使用H2O2处理，发现HSF1下调后，p-AMPK、p-GSK3β(S9)表达均下调，且细胞凋亡增多。推测LRP6可能通过促进HSF1入核，进而介导GSK3β和AMPK磷酸化抑制缺血再灌注心肌凋亡反应，从而发挥对心脏缺血再灌注损伤的保护作用。. 体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞在葡萄糖剥夺（GD）状态下LRP6表达降低。我们使用慢病毒感染干扰LRP6表达，发现基础状态下对心肌细胞活性无明显影响，但在GD状态下心肌细胞活性明显下降，而LRP6过表达则可以改善心肌细胞活性。在GD状态下，心肌细胞LRP6下调使p-DRP1(S616)水平明显升高以及p-mTOR水平升高。使用DRP1抑制剂Mdivi-1可以显著抑制LRP6干扰后GD状态下p-DRP1(S616)的升高以及p-mTOR的升高，并改善心肌细胞活性。这些结果提示，在GD状态下，大鼠乳鼠心肌细胞LRP6干扰后通过激活DRP1抑制心肌细胞活性，p-mTOR可能参与了这一过程。. 本研究阐明了LRP6对心脏缺血再灌注损伤的保护作用并对其作用机制进行了探索。发现在新生心肌细胞和成体心肌细胞中，LRP6可能通过不同的信号通路发挥作用。本研究可为心脏缺血再灌注损伤的有效干预提供新的思路，具有积极意义。