三黄汤经由NALP3炎性小体改善肥胖IR的机制研究

Insulin resistance(IR) is the core reason for the metabolic disorders in obesity, chronic inflammation and endoplasmic reticulum(ER) stress’s crosstalk of fatty tissue activate and go through the whole process of IR. Especially, NALP3 inflammasome acts as an important role in the crosstalk between the inflammation with ER stress. It is found by clinical research that a Chinese medicine herbal formula "Sanhuang Tang” with the action of clearing away heat and relieving toxin is able to relieve IR in obesity and effectively inhibit the inflammation of fatty tissue.Therefore, a hypothesis is raised, it believes that “Sanhuang Tang” relieves chronic inflammation and ER stress through NALP3 inflammasome and further improves IR in obesity.This research intends to observe the actions of “Sanhuang Tang” on the protein expression of NALP3 inflammasome in fatty tissue , inflammatory signal passway TLR4(MyD88)/IKK/NF-κB and ER stress passway TXNIP/PERK/IRE1a in vivo and at cellular level (simulate internal environment of fatty tissue, create models of inflammatory activated cell and ER stress cell) by the techniques ELISA,qPCR, Western Blot,flow cytometry and immunofluorescence in order to illustrate the mechanism of “Sanhuang Tang” treatment for IR in obesity and supply a new thinking and evidence for obesity IR treatment by Chinese herbal medicine.

胰岛素抵抗（IR）是肥胖代谢失衡的核心，脂肪组织慢性炎症和内质网（ER）应激间的crosstalk启动并贯穿IR全过程，NALP3炎性小体在慢性炎症和ER应激crosstalk中起重要纽带作用。临床研究发现清热解毒中药“三黄汤”能改善肥胖IR，并能有效抑制脂肪组织炎症，因此提出“三黄汤”经由NALP3炎性小体途径，缓解慢性炎症与ER应激，进而改善肥胖IR的研究假说。本研究拟从整体动物和细胞水平（模拟脂肪组织内环境，建立炎症激活细胞和ER应激细胞模型），运用ELISA、qPCR、Western Blot、流式细胞术、免疫荧光等技术，观察“三黄汤”对脂肪组织NALP3炎性小体、炎症信号通路TLR4(MyD88)/IKK/NF-κB及ER应激通路TXNIP/PERK /IRE1a蛋白表达的影响，诠释“三黄汤”治疗肥胖IR的机制，为中医药治疗肥胖IR提供新的思路和依据。

本研究围绕三黄汤通过抑制NALP3(又称NLRP3)炎性小体，缓解慢性炎症和内质网应激（ER应激），改善肥胖胰岛素抵抗这一科研假说进行并完成相关细胞和动物研究：1、通过DCFH-DA测定，明确过氧化氢诱导细胞模型NALP3炎症小体活化， pro Caspase-1活化形式Caspase-1 p20的表达上调， ROS水平升高，炎症因子分泌增加，证实NALP3炎性小体在慢性炎症和ER应激中的作用。2、成功建立ER应激细胞模型及炎症激活细胞模型，三黄汤有效成分干预后，可以不同程度地降低细胞模型升高的ROS水平；降低细胞模型NALP3炎性小体激活相关Caspase-1 p20的表达；同时降低细胞炎症因子分泌；三黄汤有效成分单体小檗碱、大黄酸对NF-κB 信号通路上的升高的炎症通路蛋白IKK-β总量、NF-κB 总量，IKK-β（ser181）磷酸化水平有下调作用。3、建立肥胖胰岛素抵抗（DIO）动物模型，研究显示，三黄汤能降低DIO小鼠体重，降低动物升高的血糖水平，改善DIO动物HOMA胰岛素抵抗指数，改善DIO小鼠附睾脂肪体积和脂质沉积状态，降低DIO动物血清升高的炎症因子水平，显示三黄汤对肥胖动物胰岛素抵抗的明确改善作用。4、完成炎症通路相关蛋白检测，显示相关蛋白MyD88/IKK/NF-κB表达均上调，三黄汤有效成分对升高的蛋白表达有一定下调作用，其中小檗碱、黄芩苷作用显著，但对TLR-4的表达未见明显的改变。5、完成对NALP3炎性小体干预途径的研究，研究表明三黄汤有效成分各组对NALP3激活升高的Caspase-1 p20水平均有明显下调作用，大黄酸组能明显减低升高的pro Caspase-1的水平。证实三黄汤对NALP3炎性小体的干预作用，确定三黄汤有效成分大黄酸通过pro Caspase-1/ Caspase-1 p20途径干预NALP3活化。通过上述研究证实了三黄汤对肥胖胰岛素抵抗的改善作用，明确了其对NALP3炎性小体的干预途径，并证实了其可能通过NALP3炎症小体，改善慢性炎症及ER应激，进而治疗肥胖胰岛素抵抗这样研究假说。为进一步创新开发治疗肥胖IR中药提供证据，对清热解毒中药临床推广具有重要的理论意义和研究应用前景。