HCN通道介导的内源性放电在胆红素听觉中枢兴奋毒性中的作用与机制研究

Bilirubin encephalopathy is a common clinical phenomenon observed in human newborns. Excitotoxicity is the major pathogenesis of bilirubin encephalopathy.Increased frequency of neurons action potential is the most direct and important presentation of excitotoxicity. Our previous research shows: ① in early developing stage, cochlear nucleus-the first order of auditory central neurons-exhibit spontaneous activity before hearing onset. Moreover, this spontaneous firings are independent of synaptic input and play an important role in formation and maturation of auditory circuit; ② HCN channel is the most dominant pacemaker in triggering intrinsic firing. Previous study indicate HCN channel is closely related to pathogenesis of abnormal discharge of neurons (eg.epilepsy). Pilot experiments show bilirubin can facilitate frequency of intrinsic firing in early development. In this study, we used patch-clamp technique, cell culture and cytosolic Ca2+ measurements to explore the effect of bilirubin in HCN channels-evoked spontaneous intrinsic firing. This study may provided potential new strategies for predicting, preventing, and treating bilirubin neurotoxicity.

胆红素脑病所导致的新生儿听觉障碍是临床常见疾病，兴奋毒性是主要发病机制。兴奋毒性最直接的表现是神经元放电异常增多导致凋亡坏死。申请人前期研究发现：①发育早期，听觉中枢耳蜗核神经元存在不依赖于突触传递的自发性内源性放电，其在听觉传导通路的形成过程中起到了重要作用；②超极化激活环核苷酸门控阳离子通道（HCN通道）是自发性内源性放电最主要的起搏通道。既往研究表明HCN通道与以神经元异常放电为发病基础的疾病（如癫痫）密切相关。预实验结果显示胆红素可增大自发性内源性放电频率，同时胆红素可直接促进HCN通道的开放。因此，我们通过膜片钳、钙离子成像、免疫组化、听功能测听等技术集中探讨胆红素是否通过直接作用于HCN通道，增大神经元放电频率，激活电压依赖性钙离子通道，钙离子内流触发钙超载，最终导致凋亡坏死。本研究为明确胆红素兴奋毒性机制提供了新的理论基础和研究方向。

项目研究背景：.胆红素脑病所导致的新生儿听觉障碍是临床常见疾病，兴奋毒性是主要发病机制。但目前机制不明。兴奋毒性最直接的表现是神经元放电异常增多导致凋亡坏死。既往研究发现听觉神经中枢第一级核团耳蜗核存在不依赖于突触传递的自发性内源性放电（Intrinsic Firing, IF），HCN 通道（Hyperpolarization and cyclic nucleotide-gated channels, HCN channels) 作为一种起搏通道，可以在耳蜗核介导产生IF。提示HCN通道可能作为靶点参与到高胆红素兴奋毒性机制中。.本研究项目通过电生理膜片钳技术、钙成像技术和免疫荧光技术，主要研究目标如下：.1.明确高胆红素对自发性内源性放电频率的促进作用。.2.探讨胆红素是否通过促进 HCN 通道开放引起神经元超兴奋性和兴奋毒性。 .主要研究内容及结果：.1.确定了高胆红素对自发性内源性放电频率的促进作用。.2.探讨了高胆红素促进自发性内源性放电频率的机制。其中HCN1亚型发挥了非常重要的作用。HCN通道阻断剂zd788可以拮抗高胆红素的作用。细胞膜胞吐抑制剂TAT-NSF700 可以阻断胆红素对HCN1通道的促进作用。.3.明确了胆红素通过促进 HCN 通道开放引起神经元超兴奋性和兴奋毒性。胆红素促进HCN通道电流的作用在不同类型的耳蜗核神经元具有差异。高胆红素血症模型动物(HCN1+/+-HB)神经元兴奋性增强，细胞凋亡程度增加，高频听功能受损。.科学意义：该研究有望为明确胆红素兴奋毒性机制甚至神经系统毒性机制提供新的理论基础和研究方向。并为高胆红素血症的治疗提供了新的靶点。