蜕皮激素3位异构化途径在家蚕胚胎发育中的作用

The regularity fluctuation of ecdysone titer is one of the key factors for the insect embryonic development. Previous studies have shown that ecdysone-22-phosphorylation pathway may synthesize the active ecdysone of insects required for embryonic development. In addition to this pathway, whether there are another redundant pathways that can generate active ecdysone to ensure the developmental robustness and to regulate effectively the embryonic developmental process of insects? Our preliminary results suggested that the silkworm ecdysone-C3-epimerization pathway may take part in the ecdysone activation during the early embryonic development. Based on these previous observations, the gene expression pattern, biochemical character and the corresponding functions of the silkworm Ecdysone-C3-epimerization pathway will be systematically investigated in this project. The implementation and completion of the project is expected to elucidate the functions of the pathway in early embyonic development of the silkworm (Lepidopteran insect) for the first time. The findings of this research can not only enrich our knowledge about the metabolism and the regulation mechanism of the ecdysone, which has an important theoretical significance, but also help us to artificially regulate the development of the silkworm and to develop the lepidopteran pest control technology, which has an important practical significance.

蜕皮激素规律性滴度变化是昆虫胚胎发育的关键因素之一。已有的研究表明蜕皮激素22位磷酸化途径合成了昆虫胚胎发育所需的蜕皮激素。除了该途径外还有冗余的其它途径可以生成蜕皮激素以确保昆虫胚胎发育的稳健性和有效调控胚胎发育进程吗？我们的初步研究发现家蚕蜕皮激素3位异构化途径可能参与了家蚕早期胚胎发育所需蜕皮激素的活化。本项目将在此基础上系统开展家蚕蜕皮激素3位异构化途径基因表达模式、生化途径证明和相应功能研究，该项目的实施和完成可望第一次揭示蜕皮激素3位异构化途径在家蚕（鳞翅目昆虫）早期胚胎发育中的作用及其分子机制，其研究成果不仅可以拓展我们对昆虫蜕皮激素代谢和调控机制的认知，有重要基础理论意义，而且还有助于实现对家蚕生长发育的人工控制和其它鳞翅目害虫的防治技术开发，有重要实践意义。

蜕皮激素是由昆虫前胸腺合成并分泌的，但有研究表明昆虫的早期胚胎发育是不受前胸腺控制的，而且昆虫卵内高量的蜕皮激素在前胸腺形成之前就已经存在。因此，这一时期胚胎发育所需的蜕皮激素应该是由其它途径产生的。卵形成于其母体的卵巢内，所以有可能是母体将蜕皮激素储存在卵内，以供后代胚胎发育的需要。但是，目前对于这方面的研究还不是很清楚。本项目发现在家蚕蛹期，蜕皮激素3位异构化途径的关键基因——蜕皮激素氧化酶（Ecdysone oxidase，EO）具有明显的雌卵巢偏好性表达，该途径上其它基因在该时期均为低量表达，说明由蜕皮激素3位异构化途径产生的中间体3-脱氢蜕皮激素（3-dehydroecdysone，3DE）不能被进一步转化，而在蛹内高量积累。接着，我们利用RNA干扰的方法研究雌蛹内EO基因的功能，发现EO基因表达水平的降低对蛹以及卵巢的发育没有影响，但是其子代卵内蜕皮激素水平被降低，孵化率也有显著降低，注射EO的产物3DE能够提高子代孵化率。3DE-3β-还原酶（3DE -3β-reductase）可以将3DE可逆催化为活性蜕皮激素。在胚胎发育时期，我们降低3DE -3β-reductase基因的表达同样导致卵内蜕皮激素水平以及孵化率的降低。以上的结果表明蜕皮激素3位异构化途径在家蚕早期胚胎发育所需蜕皮激素的活化过程中发挥重要作用。EO是蜕皮激素失活途径的限速酶，该基因表达水平的变化都会影响昆虫正常的发育进程。因此研究该基因的调控机制就显得尤为重要。我们的结果发现EO能够直接降解蜕皮激素，同时它的表达也是受到蜕皮激素调控的。进一步利用荧光素酶报告系统，凝胶迁移实验和染色质免疫共沉淀等方法表明EO基因的表达受蜕皮激素响应转录因子E74A的调控。通过RNAi降低家蚕E74A基因表达水平，导致EO基因表达的降低，而后者的降低则会影响蜕皮激素的代谢。在此基础上，我们发现EO基因上游调控区域有一个转座子插入，通过截断实验证实该转座子含有一个蜕皮激素相关的转录因子结合位点，并且发现该转座子能够增强下游基因对蜕皮激素的响应。表型实验进一步表明具有转座子插入的家蚕品系在经受食物短缺时发育速度不受影响，而无转座子插入的品系则会加快发育。该结果表明转座子介导的EO基因表达水平变化影响了家蚕的变态发育。本课题实施4年来已发表SCI论文6篇。已培养硕士3人、博士生2人。